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泼倡2009≥225798∈P2009≥225798A∷

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2009 泼倡 225798 P2009 225798A

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  ≮券汤の叹疚≯   ヒト拣徵蝉秽傍灰减推挛  
≮券汤荚≯   ≮会叹≯グロス·ジェイン エ〖ˉ
≮会叹≯シュ·ウェンフェン
≮会叹≯ヘンネ·ランダル エムˉ
≮会叹≯グラント·フランシス ジェイˉ
 
 
≮草玛≯ヒト拣徵蝉秽傍灰减推挛の捏丁。

≮豺疯缄檬≯泼年のアミノ焕芹误のアミノ焕荒答から联买されるアミノ焕芹误から喇る帽违されたポリペプチド、涟淡ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰、涟淡乘焕尸灰を崔んでなるベクタ〖、涟淡ベクタ〖を崔んでなる寥垂え缴肩嘿甩、涟淡缴肩嘿甩を禽蛙することを崔んでなる涟淡ポリペプチドの栏喇数恕、および攻ましくは倘敝グロブリン喇尸を崔んでなる妈2のポリペプチドに息冯された涟淡ポリペプチドを崔んでなる突圭タンパク剂。
 
≮泼钓懒滇の认跋≯
≮懒滇灌1≯
芹误戎规2のアミノ芹误のアミノ焕荒答7≥71を崔んで喇る帽违されたポリペプチド。
≮懒滇灌2≯
芹误戎规2のアミノ焕芹误のアミノ焕荒答1≥71を崔んで喇る懒滇灌1淡很の帽违されたポリペプチド。
≮懒滇灌3≯
芹误戎规2のアミノ焕芹误を崔んで喇る懒滇灌1淡很の帽违されたポリペプチド。
≮懒滇灌4≯
芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇るアミノ焕芹误を铜する懒滇灌1淡很の帽违されたポリペプチド。
≮懒滇灌5≯
∈a∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71のアミノ焕芹误、∈b∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71のアミノ焕芹误、第び∈c∷芹误戎规2のアミノ焕芹误、から喇る凡から联买されたアミノ焕芹误をコ〖ドする帽违された乘焕尸灰。
≮懒滇灌6≯
芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71を崔んで喇るアミノ焕芹误をコ〖ドする懒滇灌5淡很の帽违された乘焕尸灰。
≮懒滇灌7≯
芹误戎规1のヌクレオチド27≥578、唆は芹误戎规1のヌクレオチド45≥299のヌクレオチド芹误を崔んで喇る懒滇灌5淡很の帽违された乘焕尸灰。
≮懒滇灌8≯
懒滇灌7淡很の帽违された乘焕尸灰を崔んで喇るベクタ〖。
≮懒滇灌9≯
芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71を崔んで喇るポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰、啪继プロモ〖タ〖第び啪继タ〖ミネ〖タ〖を崔んで喇り、ここで涟淡プロモ〖タ〖が涟淡乘焕尸灰と侯脱材墙に冯圭されており、そして涟淡乘焕尸灰が涟淡啪继タ〖ミネ〖タ〖と侯脱材墙に冯圭されていることを泼魔とする券附ベクタ〖。
≮懒滇灌10≯
懒滇灌9淡很の券附ベクタ〖を崔んで喇る、嘿遁、冠熟嘿甩、幕梧嘿甩、遁梧嘿甩、韩妙嘿甩、赢讫梧嘿甩第び竣湿嘿甩から喇る凡から联买された寥垂え缴肩嘿甩。
≮懒滇灌11≯
芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71を崔んで喇るポリペプチドの栏喇数恕であって、懒滇灌9淡很の券附ベクタ〖を崔んで喇り、そして涟淡ポリペプチドを栏喇する寥垂え缴肩嘿甩を禽蛙することを崔んで喇る数恕。
≮懒滇灌12≯
涟淡禽蛙された寥垂え缴肩嘿甩から涟淡ポリペプチドを帽违することをさらに崔んで喇る懒滇灌11淡很の数恕。
≮懒滇灌13≯
懒滇灌4淡很のポリペプチドと泼佰弄に冯圭する、钩挛唆は钩挛フラグメント。
≮懒滇灌14≯
∈a∷ポリクロ〖ナル钩挛、∈b∷ネズミモノクロ〖ナル钩挛、∈c∷∈b∷统丸のヒト步钩挛、第び∈d∷ヒトモノクロ〖ナル钩挛から喇る凡から联买される懒滇灌13淡很の钩挛。
≮懒滇灌15≯
懒滇灌1淡很のポリペプチドを崔んで喇る突圭タンパク剂。
≮懒滇灌16≯
芹误戎规2のアミノ焕荒答1×71を崔んで喇る懒滇灌15淡很の突圭タンパク剂。
≮懒滇灌17≯
倘敝グロブリン喇尸をさらに崔んで喇る懒滇灌15唆は16淡很の突圭タンパク剂。
 
≮券汤の拒嘿な棱汤≯≮祷窖尸填≯
≮0001≯
塑券汤は办忍弄に、ヒト嘿甩により券附される糠惮タンパク剂に簇する。泼に、塑券汤は、∪Ztnfr12∩と疚する减推挛をコ〖ドする糠惮颁帕灰、第びZtnfr12ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰に簇する。
≮秦肥祷窖≯
≮0002≯
サイトカインは、驴くの嘿甩房の笼浚第び尸步の拇泪を蜀崔する硷」の栏湿池弄跟蔡を苗拆する材拖拉の井さなタンパク剂である∈毋えば、Araiなど., Annu. Rev. Biochem. 56: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76: 241 (1994) を徊救のこと∷。サイトカイングル〖プを菇喇するタンパク剂は、インタ〖ロイキン、インタ〖フェロン、コロニ〖簧枫傍灰、拣徵蝉秽傍灰第び戮の拇泪尸灰を蜀崔する。毋えば、ヒトインタ〖ロイキン≥17は、インタ〖ロイキン≥6、嘿甩柒烧缅尸灰1、インタ〖ロイキン≥8、瘗纬靛マクロファ〖ジコロニ〖簧枫傍灰の券附、第びプロスタグランジンE2券附を簧枫し、そしてCD34+陇缝涟额挛の攻面靛への联买弄喇较において舔充を遍じるサイトカインである。∈Yaoなど., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez など., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)∷。
≮0003≯
サイトカインを冯圭する减推挛は诺房弄には、光い科下拉でサイトカインを冯圭し、そしてこの冯圭附据を、办年の减推挛サブユニットの嘿甩剂婶尸を奶して嘿甩にトランスダクションする1唆は剩眶の遂柒哼拉タンパク剂から菇喇される。サイトカイン减推挛は、それらの嘿甩嘲リガンド冯圭ドメインにおける梧击拉に答づいて、いくつかのクラスに尸梧されている。毋えば、インタ〖フェロンの冯圭第び/唆はその跟蔡のトランスダクションを么碰する减推挛嚎は、泼魔弄な200改の荒答の嘿甩嘲ドメインに答づいて、タイプIIサイトカイン减推挛ファミリ〖のメンバ〖である。
≮0004≯
倘敝炳批の粗に栏じる嘿甩陵高侯脱は、いくつかの嘿甩山烫减推挛ファミリ〖、毋えば拣徵蝉秽傍灰减推挛∈TNFR∷ファミリ〖のメンバ〖により拇泪される。TNFRファミリ〖は、驴くの遂柒哼拉劈タンパク剂から喇り、それらの驴くは、それらのそれぞれのリガンドと鼎に、佰なった陇缝嘿甩废粗での陵高侯脱を拇泪する∈毋えば、Cosman, Stem Cells 12: 440 (1994); Wajantなど., Cytokine Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yehなど., Immunol. Rev. 169: 283 (1999); Idriss and Naismith, Microsc. Res. Tech. 50: 184 (2000)を徊救のこと∷。
≮0005≯
1つのそのような减推挛は、TACI、トランスメンブラン宠拉步傍灰第びCAML陵高侯脱挛である∈von Bulow and Bram. Science 228: 138 (1997); PCT给倡WO98/39361规∷。TACIは、2硷のシステインに少んでいる导击瓤牲挛を崔む嘿甩嘲ドメイン、トランスメンブランドメイン第びCAML∈カルシウムモジュレ〖タ〖第びシクロフィリンリガンド∷と陵高侯脱する嘿甩剂ドメインを铜する遂冯圭减推挛、すなわちJurkat嘿甩において册娟券附される眷圭、NF≥AT宠拉步の票箕インジュ〖サ〖である、嘿甩柒井甩に疤弥する遂柒哼拉タンパク剂である。TACIは、B嘿甩、第びT嘿甩のサブセットにより柴圭される。
≮0006≯
拣徵蝉秽傍灰减推挛の汤らかにされたインビボ宠拉は、戮のそのような减推挛、第び拣徵蝉秽傍灰减推挛アゴニスト第びアンタゴニストの巫静池弄材墙拉、第びそれについての涩妥拉を绩す。
≮券汤の车妥≯
≮0007≯
塑券汤は、∪Ztnfr12∩と疚する糠惮拣徵蝉秽傍灰减推挛を捏丁する。塑券汤はまた、Ztnfr12ポリペプチド第びZtnfr12突圭タンパク剂、事びにそのようなポリペプチド第びタンパク剂をコ〖ドする乘焕尸灰、第びそれらの乘焕尸灰第びアミノ焕芹误の蝗脱数恕を捏丁する。
≮哭烫の词帽な棱汤≯
≮0008≯
≮哭1≯哭1は、IgG1サブクラスの倘敝グロブリンの哭である。CL¨L嚎稍恃挝拌〃CH1, CH2, CH3: H嚎稍恃挝拌〃VL¨L嚎材恃挝拌〃VH¨H嚎材恃挝拌〃CHO¨煤垮步湿〃N¨アミノ琐眉〃C¨カルボキシル琐眉。
≮券汤を悸卉するための妨轮≯
≮0009≯
券汤の泼年の淡很¨
1ˉ车囱
ZTNF4は、拣徵蝉秽傍灰∈TNF∷リガンドファミリ〖のメンバ〖である∈芹误戎规5∷。この尸灰はまた、∪BAFF∩、∪BlyS∩、∪TALL≥1∩第び∪THANK∩としても炭叹されている∈Mooreなど., Science 285: 269 (1999); Mukhopadhyayなど., J. Biol. Chem. 274: 15978 (1999); Schnoiderなどˉ·JˉExp. Med. 189: 1747 (1999); Shuなどˉ·J. Leukoc. Biol. 65: 680 (1999)∷。ZTNF4と冯圭する肌の2硷の减推挛が票年されている¨トランスメンブラン宠拉步傍灰第びCAML陵高侯脱挛∈TACI∷第びβ≥嘿甩喇墓傍灰∈BCMA∷∈Grossなど., Nature 404: 999 (2000)∷。
≮0010≯
ビオチニル步されたZTNF4が、このリガンドのための材墙拉ある糠惮减推挛を票年するために蝗脱された。それらの甫垫においては、办凡の拣徵嘿甩へのビオチニル步されたZTNF4の冯圭が、萎瓢嘿甩纷卢恕を脱いて卢年された。睹くべきことには、ZTNF4は、TACIに滦するモノクロ〖ナル钩挛唆はBCMAに滦するポリクロ〖ナル钩挛のいずれかによる嘿甩の冯圭がほとんど赂哼しない眷圭でさえ、ヒトB≥リンパ涟额挛嘿甩废∈REH嘿甩∷に冯圭することが斧叫された。梧击する冯蔡が、ヒトリンパ拣に统丸するBJAB嘿甩により斧叫された。それらの囱弧は、ZTNF4がTACI唆はBCMA笆嘲の减推挛と冯圭したことを绩した。
≮0011≯
さらにこの材墙拉を拇汉するために、125I≥ラベルされたZTNF4がB≥リンパ涟额挛嘿甩に冯圭し、そして嘿甩山烫尸灰に蛤汗された。钩≥ZTNF4ポリクロ〖ナル钩挛による借妄は庶纪拉睦怕湿を栏喇したが、ところが钩≥TACI唆は钩≥BCMAポリクロ〖ナル钩挛による借妄は庶纪拉睦怕湿を栏喇しなかった。骄って、このデ〖タは、糠惮减推挛が嘿甩へのZTNF4の冯圭の付傍である簿棱を毁积した。∪Ztnfr12∩として炭叹された涟淡减推挛が、毋1に淡很淡很のようにして帽违された。冯圭甫垫は、その糠惮减推挛がZTNF4を冯圭したが、しかし∩ZTNF2∪として炭叹されたリガンド∈芹误戎规6∷を冯圭しなかったことを绩した。ZTNF2はまた∪APRIL∩第び∪TNRF秽舜リガンド≥1∩としても炭叹されている∈Hahneなど., J. Exp. Med. 188: 1185 (1998); Kellyなど., Cancer Res. 60: 1021 (2999)∷。
≮0012≯
Ztnfr12の冯圭泼拉がまた、寥垂え缴肩嘿甩を脱いて拇べられた。灰丁のハムスタ〖空隆嘿甩が、Ztnfr12コ〖ド芹误を崔んで喇る券附ベクタ〖によりトランスフェクトされ、そしてそのトランスフェクトされた嘿甩が125I≥ラベルされたZTNF4による冯圭甫垫に蝗脱された。冯圭甫垫第びスキャッチャ〖ド尸老は、Ztnfr12に滦するZTNF4のKdが1.0nMであり、これは、TACI券附ベクタ〖によりトランスフェクトされた灰丁ハムスタ〖空隆嘿甩により券附されるTACI减推挛に滦するZTNF4のKd∈1.25nM∷に嗓浓できることを绩した。トランスフェクトされた嘿甩は、嘿甩碰たり腆150∵106のZtnfr12嘿甩山烫减推挛を券附した。
≮0013≯
ZTNF4は、悸剂弄にすべての喇较CD19+琐究B嘿甩に滦して冯圭し、裹狂における踏喇较B嘿甩に滦して煎く冯圭し、そしてほとんどの妨剂啪垂されたB嘿甩に滦して冯圭するように蛔える。しかしながら、いくつかのBリンパ拣、REH第びBJABは毋えば、ZTNF4を冯圭するが、しかし努磊なレベルのTACI唆はBCMAのいずれも券附しない。さらに、TACI第びBCMA山烫券附第びZTNF4冯圭が、萎瓢嘿甩纷卢恕を脱いて、侉彭、琐究缝闭第び裹狂から帽违された嘿甩に滦して疯年された。その冯蔡は、TACI第びBCMAがヒト侉彭第び琐究缝闭におけるほとんどの踏喇较B嘿甩礁媚、すなわちIgM+IgD-惧で呵光レベルで券附されることを绩す。
≮0014≯
尉减推挛の券附レベルは、より喇较したIgM+IgD+B嘿甩の山烫惧で你布し、そしてIgM-IgD+B嘿甩、すなわちB嘿甩喇较の呵も喇较した檬超を山す礁媚惧で润撅に你いレベルで斧叫される。しかしながら、ZTNF4リガンドは、悸剂弄にすべての喇较B嘿甩に、光レベルで冯圭する。办斤に雇胃すると、それらのデ〖タは、いくつかのB嘿甩拣徵第び琐究ヒトB嘿甩惧でのZTNF4のための纳裁の减推挛の赂哼を蜀崔する。それらのデ〖タは、Ztnfr12がほとんどの喇较IgM-IgD+B嘿甩惧で呵光レベルで券附され、そしてこの礁媚への呵光レベルのzTNF4冯圭の付傍であり评ることを绩す。
≮0015≯
Ztnfr12をコ〖ドする毋绩のヌクレオチド芹误は、芹误戎规1により捏丁される。そのコ〖ドされるポリペプチドは、肌のアミノ焕芹误を铜する¨MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD KDAPEPLDKV IILSPGISDA PAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG PEQQ∈芹误戎规2∷。Ztnfr12ポリペプチドの泼魔は、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79を崔んで喇る嘿甩嘲ドメイン、芹误戎规2のアミノ焕荒答70≥100唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答80≥100を崔んで喇るトランスメンブランドメイン、第び芹误戎规2のアミノ焕荒答101≥184での嘿甩柒ドメインを蜀崔する。
≮0016≯
Ztnfr12颁帕灰を崔むヌクレオチド芹误は、芹误戎规9により捏丁される。Ztnfr12颁帕灰は3改のエキソンを崔んで喇る。芹误戎规2のアミノ焕に簇しては、エキソン1はアミノ焕荒答1×アミノ焕46のためのコドンの妈1ヌクレオチドをコ〖ドし、エキソン2はアミノ焕46の荒り×アミノ焕123のためのコドンの妈1ヌクレオチドをコ〖ドし、そしてエキソン3はアミノ焕123の荒り×アミノ焕184をコ〖ドする。3∏≥踏溯条挝拌は芹误戎规9のヌクレオチド2405×腆5720を崔む。山1はこのヌクレオチド芹误のさらなる泼魔を捏丁する。
≮0017≯
≮山1≯


≮0018≯
Ztnfr12颁帕灰は厉咖挛22q13.2に赂哼し、そしてZtnfr12はほとんどのリンパ寥骏∈毋えばリンパ泪寥骏∷、B≥嘿甩拣徵第び骢面看B≥嘿甩において券附される。ノザン第びドットブロット尸老は、Ztnfr12颁帕灰券附が纾隆、リンパ泪、琐究缝闭リンパ靛、空隆、看隆、次隆、裹呈囤、绻隆、甥空、篮零、蔷、灰弟、斑、裹狂、丹瓷、痘粒、论茸、论基次隆第びRaji嘿甩において浮叫できることを绩した。呵も动いシグナルは、纾隆第びリンパ泪寥骏と冯圭されるが、ところが煎いシグナルは蔷、灰弟第び论茸寥骏により冯圭される。骄って、Ztnfr12钩挛第び乘焕プロ〖ブは、それらの寥骏粗で尸步するために蝗脱され评る。
≮0019≯
布淡のように、塑券汤は、∈a∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、∈b∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、∈c∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、∈d∷芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、∈e∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、∈f∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、∈g∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39、∈h∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、∈i∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、∈j∷芹误戎规2のアミノ焕荒答70≥100、∈k∷芹误戎规2のアミノ焕荒答80≥100、∈l∷芹误戎规2のアミノ焕荒答101≥184、第び∈m∷芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇る凡から联买された滦救アミノ焕芹误に滦して警なくとも70◇、警なくとも80◇、唆は警なくとも90◇票办であるアミノ焕芹误を崔んで喇る、芹误戎规2のアミノ焕芹误唆は芹误戎规10のアミノ焕芹误のいずれかから喇るポリペプチドと泼佰弄に冯圭する钩挛と泼佰弄に冯圭する帽违されたポリペプチドを捏丁する。
≮0020≯
办年のZtnfr12ポリペプチドは、芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇るポリペプチドと泼佰弄に冯圭する钩挛と泼佰弄に冯圭する。办年のZtnfr12ポリペプチドは、ZTNFを泼佰弄に冯圭し、そして戮のポリペプチドは、ZTNF4を泼佰弄に冯圭するが、しかしZTNF2を泼佰弄に冯圭しない。毋绩弄なZtnfr12ポリペプチドは、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答80≥100、芹误戎规2のアミノ焕荒答70≥100、芹误戎规2のアミノ焕荒答101≥184、第び芹误戎规2のアミノ芹误を崔んで喇るか唆はそれらから喇るポリペプチドを蜀崔する。
≮0021≯
塑券汤はまた、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39の警なくとも15改、唆は警なくとも30改の息鲁アミノ焕荒答を崔んで喇る帽违されたポリペプチドを捏丁する。
≮0022≯
塑券汤はさらに、警なくとも1つのZtnfr12エキソンによりコ〖ドされるポリペプチドを捏丁する。毋えば、そのようなポリペプチドは、芹误戎规2の肌のアミノ焕から喇ることができる¨アミノ焕荒答1≥45、アミノ焕荒答47≥122、第びアミノ焕荒答124≥184。
≮0023≯
塑券汤はまた、恃佰挛Ztnfr12ポリペプチドを蜀崔し、ここで涟淡恃佰挛ポリペプチドのアミノ焕芹误は、警なくとも70◇の票办拉、警なくとも80◇の票办拉、警なくとも90◇の票办拉、警なくとも95◇の票办拉唆は95◇笆惧の票办拉から喇る凡から联买された、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥184との票办拉を鼎铜し、そして涟淡恃佰挛ポリペプチドのアミノ焕芹误と芹误戎规2のアミノ焕芹误との粗のいずれかの汗佰は1唆は剩眶の瘦赂拉アミノ焕弥垂によるものである。
≮0024≯
塑券汤はさらに、そのようなポリペプチドと泼佰弄に冯圭する钩挛第び钩挛フラグメントを捏丁する。诺房弄な钩挛は、ポリクロ〖ナル钩挛、ネズミモノクロ〖ナル钩挛、ネズミモノクロ〖ナル钩挛に统丸するヒト步钩挛第びヒトモノクロ〖ナル钩挛を蜀崔する。毋绩弄な钩挛フラグメントは、F(ab∏)2, F(ab)2, Fab∏, Fab ·Fv, scFv第び呵警千急帽疤を蜀崔する。塑券汤はさらに、キャリヤ〖、第び塑汤嘿今に淡很されるペプチド、ポリペプチド、钩挛唆は钩≥イディオタイプ钩挛を崔んで喇る寥喇湿を捏丁する。
≮0025≯
塑券汤はまた、∈a∷芹误戎规3のヌクレオチド芹误を崔んで喇る乘焕尸灰、∈b∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥184を崔んで喇るアミノ焕芹误をコ〖ドする乘焕尸灰、第び∈c∷芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误、芹误戎规1のヌクレオチド27≥233のヌクレオチド芹误、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578の陵输挛、唆は芹误戎规1のヌクレオチド27≥233の陵输挛を崔んで喇る乘焕尸灰に滦して、钝教丽爵掘凤布でハイブリダイズされたまま赂鲁する乘焕尸灰から喇る凡から联买された、Ztnfr12ポリペプチドをコ〖ドする帽违された乘焕尸灰を捏丁する。毋绩弄な乘焕尸灰は、乘焕尸灰∈c∷によりコ〖ドされるアミノ焕芹误と芹误戎规2のその滦炳するアミノ焕芹误との粗のいずれかの汗佰が瘦赂拉アミノ焕弥垂のためであるそれらの乘焕を蜀崔する。
≮0026≯
塑券汤はさらに、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578∈芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥184をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド27≥233∈芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド27≥263∈芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド45≥233∈芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド45≥263∈芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド45≥143∈芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド81≥131∈芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド27≥239∈芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド45≥239∈芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71をコ〖ドする∷、芹误戎规1のヌクレオチド327≥578∈芹误戎规2のアミノ焕荒答101≥184をコ〖ドする∷を崔んで喇る帽违された乘焕尸灰を措茶する。
≮0027≯
塑券汤はまた、Ztnfr12エキソン唆はイントロンのヌクレオチド芹误から喇る乘焕尸灰を捏丁する。それらのエキソン第びイントロのヌクレオチド芹误が山1に票年される。
≮0028≯
塑券汤はまた、そのような乘焕尸灰を崔んで喇るベクタ〖第び券附ベクタ〖を蜀崔する。そのような券附ベクタ〖は、啪继プロモ〖タ〖第び啪继タ〖ミネ〖タ〖を崔んで喇り、ここで涟淡プロモ〖タ〖が涟淡乘焕尸灰と侯脱材墙に冯圭され、そして涟淡乘焕尸灰が涟淡啪继タ〖ミネ〖タ〖と侯脱材墙に冯圭される。塑券汤はさらに、それらのベクタ〖第び券附ベクタ〖を崔んで喇る寥垂え缴肩嘿甩第び寥垂えウィルスを蜀崔する。毋绩弄な缴肩嘿甩は、嘿遁、幕梧、冠熟、遁梧、韩妙、赢讫梧第び竣湿を蜀崔する。そのような券附嘿甩を崔んで喇る寥垂え缴肩嘿甩は、券附ベクタ〖を崔んで喇り、そしてZtnfr12タンパク剂を栏喇するそのような寥垂え缴肩嘿甩を禽蛙し、そして扦罢には、禽蛙された寥垂え缴肩嘿甩からZtnfr12タンパク剂を帽违することによって、Ztnfr12ポリペプチドを栏喇するために蝗脱され评る。塑券汤はさらに、そのような数恕の栏喇湿を蜀崔する。
≮0029≯
塑券汤はまた、芹误戎规13のアミノ焕荒答1≥69を崔んで喇るポリペプチド、芹误戎规13のアミノ焕荒答1≥69の警なくとも10、警なくとも15、警なくとも20、警なくとも25唆は警なくとも30改の息鲁したアミノ焕荒答を崔んで喇るポリペプチド、芹误戎规13のアミノ焕荒答21≥38を崔んで喇るポリペプチド、芹误戎规13のアミノ焕荒答1≥69を崔んで喇る突圭タンパク剂、そのようなアミノ焕芹误をコ〖ドする乘焕尸灰、そのような乘焕尸灰を崔んで喇る券附ベクタ〖、第びそのような券附ベクタ〖を崔んで喇る寥垂え缴肩嘿甩を捏丁する。塑券汤はさらに、そのような寥垂え缴肩嘿甩を脱いてネズミZtnfr12ポリペプチドを栏喇するための数恕を蜀崔する。
≮0030≯
TACI, BCMA, ヒトZtnfr12第びネズミZtnfr12のアミノ焕芹误の办误腊误は、嘿甩嘲ドメインの肌のモチ〖フ¨
C[NVPS][QPE][TAEN][EQ][CY][FW]D[PLS]L[VL][RGH][NHTA]C[VMI][SAP]Cを山し、ここで疥年の疤弥についての钓推できるアミノ焕が逞房崇柑柒に绩される∈芹误戎规46∷。塑券汤は、このモチ〖フから喇るアミノ焕芹误を铜する、ZTNF4を冯圭するポリペプチドを蜀崔する。塑券汤はまた、このモチ〖フから喇るアミノ焕芹误を铜するポリペプチドに冯圭する钩挛を蜀崔する。
≮0031≯
さらに、塑券汤は、板挑弄に钓推できるキャリヤ〖、第び券附ベクタ〖唆はそのような券附ベクタ〖を崔んで喇る寥垂え2ウィルスの警なくとも1つを崔んで喇る板挑寥喇湿を捏丁する。塑券汤はさらに、板挑弄に钓推できるキャリヤ〖第び塑汤嘿今に淡很されるポリペプチドを崔んで喇る板挑寥喇湿を蜀崔する。
≮0032≯
塑券汤はまた、栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12 RNAの赂哼を浮叫するための数恕を捏丁し、ここで涟淡数恕は、∈a∷Ztnfr12乘焕プロ〖ブと、∈i∷涟淡栏湿池弄サンプルから帽违された活赋RNA尸灰、唆は∈ii∷涟淡帽违されたRNA尸灰から圭喇された乘焕尸灰のいずれかとを、ハイブリダイゼ〖ション掘凤布で儡卡せしめ、ここで涟淡プロ〖ブが、芹误戎规1のヌクレオチド芹误の办婶、唆はその陵输挛から喇るヌクレオチド芹误を崔んで喇り〃そして∈b∷涟淡乘焕プロ〖ブ、第び涟淡活赋RNA尸灰唆は圭喇された乘焕尸灰のいずれかのハイブリッドの妨喇を浮叫し、ここで涟淡ハイブリッドの赂哼が涟淡栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12 RNAの赂哼を绩す。毋えば、努磊なプロ〖ブは、肌のヌクレオチドから喇る¨芹误戎规1のヌクレオチド27≥578第び芹误戎规1のヌクレオチド27≥233。戮の努磊なプロ〖ブは、それらのヌクレオチド芹误の陵输挛、唆は塑汤嘿今に淡很されるようなヌクレオチド芹误唆はそれらの陵输挛の办婶から喇る。
≮0033≯
塑券汤はさらに、栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12の赂哼を浮叫するための数恕を捏丁し、ここで涟淡数恕は、∈a∷涟淡栏湿池弄サンプルと、芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇るポリペプチドと泼佰弄に冯圭する钩挛、唆は钩挛フラグメントとを儡卡せしめ、ここで涟淡儡卡が、涟淡栏湿池弄サンプルへの涟淡钩挛唆は钩挛フラグメントの冯圭を材墙にする掘凤布で乖われ、そして∈b∷涟淡冯圭された钩挛唆は冯圭された钩挛フラグメントのいずれかを浮叫する檬超を崔んで喇る。そのような钩挛唆は钩挛フラグメントはさらに、庶纪挛票疤挛、分各ラベル、步池ルミネセントラベル、冠燎ラベル、栏湿ルミネセントラベル第びコロイド觉垛から喇る凡から联买された浮叫できるラベルを崔んで喇る。
≮0034≯
塑券汤はまた、それらの浮叫数恕を乖うためのキットを捏丁する。毋えば、Ztnfr12颁帕灰券附の浮叫のためのキットは、乘焕尸灰を崔んで喇る推达を崔んで喇り、ここで涟淡乘焕尸灰は、∈a∷芹误戎规1のヌクレオチド27≥233のヌクレオチド芹误を崔んで喇る乘焕尸灰、∈b∷芹误戎规1のヌクレオチド芹误のヌクレオチド27≥233の陵输挛を崔んで喇る乘焕尸灰、第び∈c∷警なくとも8改のヌクレオチドから喇る∈a∷唆は∈b∷のフラグメントである乘焕尸灰から喇る凡から联买される。そのようなキットはまた、乘焕尸灰の赂哼を绩すことができる1唆は剩眶の活挑を崔んで喇る妈2推达を崔んで喇る。戮数では、Ztnfr12タンパク剂の浮叫のためのキットは、芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇るポリペプチドと泼佰弄に冯圭する、钩挛唆は钩挛フラグメントを崔んで喇る推达を崔んで喇る。
≮0035≯
塑券汤はまた、芹误戎规2のアミノ焕芹误から喇るポリペプチドを泼佰弄に冯圭する钩挛唆は钩挛フラグメントを泼佰弄に冯圭する、钩≥イディオタイプ钩挛唆は钩≥イディオタイプ钩挛フラグメントも措茶する。诺房弄な钩≥イディオタイプ钩挛は、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71から喇るポリペプチドを泼佰弄に冯圭する钩挛と冯圭する。
≮0036≯
塑券汤はまた、Ztnfr12ポリペプチド第び倘敝グロブリン喇尸を崔んで喇る突圭タンパク剂を捏丁する。そのような突圭タンパク剂においては、倘敝グロブリン喇尸は、倘敝グロブリンH嚎稍恃挝拌、毋えばヒトFcフラグメントであり评る。塑券汤はさらに、そのような突圭タンパク剂をコ〖ドする帽违された乘焕尸灰を蜀崔する。
≮0037≯
塑券汤はさらに、Ztnf12∈毋えば、、ZTNF4∷を冯圭するリガンドの宠拉を、赢讫梧において了巢するための数恕を蜀崔し、ここで涟淡数恕は、∈a∷材拖拉Ztnfr减推挛、∈b∷Ztnfr12の嘿甩嘲ドメインと泼佰弄に冯圭する钩挛唆は钩挛フラグメント、第び∈c∷Ztnfr12の嘿甩嘲ドメインを崔んで喇る突圭タンパク剂の警なくとも1つを崔んで喇る寥喇湿を、涟淡赢讫梧に抨涂することを崔んで喇る。毋绩として、そのような寥喇湿は、Bリンパ靛、宠拉步されたBリンパ靛、唆は蒂贿Bリンパ靛に簇息する俱巢第び祭陕を借妄するために蝗脱され评る。
≮0038≯
塑汤嘿今に淡很される尸灰により借妄され评るB嘿甩リンパ拣の毋は、バ〖キットリンパ拣、润バ〖キットリンパ拣、润ホドキンリンパ拣、驴券拉裹狂拣、井甩拉リンパ拣、缔拉リンパ碴靛拉球缝陕、她拉リンパ拉球缝陕、络嘿甩リンパ拣、件憋挝拌リンパ拣、蕊遂嘿甩リンパ拣、络嘿甩リンパ拣∈毋えば、倘敝碴靛拉リンパ拣∷、井リンパ拉リンパ拣第び戮のB嘿甩リンパ拣を蜀崔する。そのような寥喇湿はまた、T嘿甩リンパ拣、毋えばリンパ碴靛拉リンパ拣、锣拉络嘿甩リンパ拣、乳涉T嘿甩リンパ拣、琐究T嘿甩リンパ拣、缝瓷拉倘敝碴靛リンパ拣、缝瓷面旷リンパ拣、牟T嘿甩リンパ拣、喇客T嘿甩リンパ拣、喇客T嘿甩球缝陕第び票屯のものを借妄するために蝗脱され评る。
≮0039≯
毋えば、塑券汤は、拣徵嘿甩∈毋えば、B嘿甩リンパ拣嘿甩唆はT嘿甩リンパ拣嘿甩∷の笼浚を了巢するための数恕を蜀崔し、ここで涟淡数恕は、∈a∷材拖拉Ztnfr减推挛、∈b∷Ztnfr12の嘿甩嘲ドメインと泼佰弄に冯圭する钩挛唆は钩挛フラグメント、第び∈c∷Ztnfr12の嘿甩嘲ドメインを崔んで喇る突圭タンパク剂の警なくとも1つを崔んで喇る寥喇湿を、涟淡拣徵嘿甩に抨涂することを崔んで喇る。そのような栏喇湿は、インビトロで禽蛙される嘿甩に抨涂され评る。戮数では、涟淡寥喇湿は、板挑寥喇湿であり评、そして涟淡板挑寥喇湿は、拣徵を铜する滦据に抨涂される。
≮0040≯
突圭タンパク剂の1つの毋は、Ztnfr12の嘿甩嘲ドメイン、芹误戎规2のアミノ焕1≥69を崔んで喇るポリペプチドのフラグメントを崔んで喇るZtnfr12ポリペプチド、第び倘敝グロブリンの稍恃挝拌を崔んで喇る倘敝グロブリン喇尸を崔んで喇るZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂である。毋绩弄な倘敝グロブリン喇尸は、H嚎稍恃挝拌を崔んで喇る。Ztnfr12≥倘敝のグロブリン突圭タンパク剂は、布淡で侠じられるように、モノマ〖、ダイマ〖唆は戮の芹误のものであり评る。
≮0041≯
もう1つの毋においては、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸を崔んで喇る寥喇湿は、嘿甩の笼浚を了巢するために拣徵嘿甩に抨涂される。涟淡寥喇湿はインビトロで禽蛙される嘿甩に抨涂され评、唆は拣徵を铜する滦据において抨涂される板挑寥喇湿であり评る。そのような寥喇湿は、顽のZtnfr12钩挛である钩≥Ztnfr12钩挛喇尸を崔んで喇り、唆はそのような寥喇湿は顽のZtnfr12钩挛フラグメントである钩≥Ztnfr12钩挛喇尸を崔んで喇る。さらに、寥喇湿は、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸第び迹闻恨を崔んで喇る倘敝儡圭挛を崔むことができる。毋绩弄な迹闻恨は、步池闻恕恨、嘿甩魄燎、イムノモジュレ〖タ〖、キレ〖ト步恨、怙燎步圭湿、各宠拉恨、各宠拉咖燎第び庶纪拉票疤挛を蜀崔する。
≮0042≯
そのような寥喇湿は、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸、第びイムノモジュレ〖タ〖唆は嘿甩魄燎ポリペプチドのいずれかを崔んで喇る钩挛突圭タンパク剂を崔んで喇ることができる。寥喇湿のいずれかの妨は、钩≥Ztnfr12顽钩挛喇尸、第び警なくとも1つの钩≥BCMA顽钩挛喇尸、事びに钩≥TACI顽钩挛喇尸を崔んで喇る驴泼佰弄钩挛である。毋绩弄な驴泼佰弄钩挛寥喇湿は、Ztnfr12、第びBCMA第びTACIの警なくとも1つを冯圭する企泼佰弄钩挛を崔んで喇る。驴泼佰弄钩挛寥喇湿はさらに、迹闻恨を崔んで喇る。さらに、驴泼弄钩挛寥喇湿は、∈a∷イムノモジュレ〖タ〖唆は嘿甩魄拉ポリペプチドのいずれかを崔んで喇る钩≥Ztnfr12钩挛突圭タンパク剂、第び∈b∷钩≥BCMA钩挛喇尸唆は钩≥TACI钩挛喇尸の警なくとも1つを崔んで喇ることができる。
≮0043≯
Ztnfr12嘿甩嘲ドメイン唆は钩〗Ztnfr12钩挛のいずれかを崔んで喇るポリペプチドは、极甘倘敝祭吹を借妄するために蝗脱され评る。极甘倘敝祭吹の毋は、链咳拉エリテマ〖トデス、脚旧囤痰蜗旧、驴券拉古步旧、インスリン巴赂拉靠拉劈洽陕第びリウマチ屯簇泪标を蜀崔する。Ztnfr12嘿甩嘲ドメイン唆は钩≥Ztnfr12钩挛を崔んで喇るポリペプチドはまた、ぜん漏、丹瓷毁标、丹拣、第び呵姜檬超空稍链唆は空祭吹を借妄するためにも蝗脱され评る。毋绩弄な空祭吹は、诲靛挛空标、坍瓷标、她拉リンパ球缝陕、空标第び空獬空标を蜀崔する。Ztnfr12嘿甩嘲ドメイン唆は钩≥Ztnfr12钩挛を崔んで喇るポリペプチドはさらに、空糠栏湿、驴券拉裹狂拣、リンパ拣、L嚎ニュ〖ロパシ〖唆はアミロイド旧を借妄するために蝗脱され评る。
≮0044≯
塑券汤はまた、ZTNF4宠拉がエフェクタ〖T嘿甩に簇息される、ZTNF4宠拉を了巢するための数恕も蜀崔する。簇息する数恕においては、ZTNF4宠拉が倘敝炳批の拇泪に簇息される。もう1つの数恕においては、ZTNF4宠拉が、倘敝娃扩に簇息される。さらにもう1つの数恕においては、倘敝娃扩は、败竣室雕冷、滦缴肩拉败竣室陕唆は标旧に簇息される。さらにもう1つの数恕においては、倘敝娃扩は极甘倘敝祭吹に簇息される。毋绩としての极甘倘敝吹荚はインスリン≥巴赂拉靠拉劈洽陕唆はクロ〖ン陕であり评る。さらに戮の数恕においては、倘敝娃扩は标旧に簇息している。そのような标旧は、毋えば簇泪乃、拣磨、上缝唆は窃缝拉ショックに簇息している。
≮0045≯
塑券汤はまた、∈a∷滦据の栏湿池弄サンプルから帽违されたゲノムDNAから、∈i∷警なくとも1つのZtnfr12エキソン1×3をコ〖ドするヌクレオチド芹误を崔んで喇るか、唆は∈ii∷涟淡∈i∷の陵输挛であるヌクレオチド芹误を崔んで喇るいずれかである乘焕尸灰を笼升し、そして∈b∷涟淡笼升された乘焕尸灰における仆脸恃佰∈この仆脸恃佰の赂哼が厉咖挛22q13.2佰撅を绩す∷を浮叫することによって、滦据における厉咖挛22q13.2佰撅拉を浮叫するための数恕を蜀崔する。それらの数恕の恃恕においては、浮叫檬超は、芹误戎规1唆は9のヌクレオチド芹误に滦して、笼升された乘焕尸灰のヌクレオチド芹误を孺秤することによって乖われる。
≮0046≯
塑券汤はさらに、∈a∷滦据の栏湿池弄サンプルから帽违されたゲノムDNAから、警なくとも1つのイントロン1第びイントロン2のヌクレオチド芹误、唆は警なくとも1つのイントロン1第びイントロン2の陵输弄ヌクレオチド芹误のいずれかを崔んで喇るZtnfr12のセグメントを笼升し、そして∈b∷涟淡笼升された乘焕尸灰における仆脸恃佰∈この仆脸恃佰の赂哼が厉咖挛22q13.2佰撅を绩す∷を浮叫することを崔んで喇る、滦据における厉咖挛22q13.2佰撅拉を浮叫するための数恕を捏丁する。それらの数恕の恃恕においては、浮叫檬超は、涟淡笼升されたZtnfr12颁帕灰セグメントを遂に冯圭し、そして涟淡遂と乘焕プロ〖ブとを、光い钝教掘凤布で儡卡せしめることによって乖われ、ここでハイブリッドの稍哼がZtnfr12の券附に簇息する佰撅拉、唆は厉咖挛22q13.2における仆脸恃佰を绩す。毋绩としての努磊な乘焕プロ〖ブは、イントロン1第び2のいずれか1つのヌクレオチド芹误∈唆はそのヌクレオチド芹误の输挛∷を崔んで喇ることができる。
≮0047≯
Ztnfr12颁帕灰唆はその颁帕灰栏喇湿の仆脸恃佰唆は恃构の毋は、爬仆脸恃佰、风己、赁掐第び啪败を蜀崔する。Ztnfr12に颁帕灰仆脸恃佰のもう1つの毋は、佰眶拉である。塑券汤はまた、塑汤嘿今に淡很される浮叫数恕を脱いての、Ztnfr12颁帕灰の妈1エキソンの惧萎の挝拌∈毋えば、芹误戎规9のヌクレオチド1≥1000柒∷における恃构の票年を崔んで喇る、滦据における厉咖挛22q13.2佰撅拉を浮叫するための数恕を蜀崔する。
塑券汤のそれらの第び戮の囱爬は、肌の泼年の淡很に答づいて汤らかになるであろう。さらに、硷」の矢弗が布淡に票年される。
≮0048≯
2ˉ年盗
肌の淡很においては、驴くの脱胳が弓认跋に蝗脱される。肌の年盗は、塑券汤の妄豺を楼渴するために捏丁される。
≮0049≯
塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、∪乘焕∩唆は∪乘焕尸灰∩とは、ポリヌクレオチド、毋えばデオキシリボ乘焕∈DNA∷唆はリボ乘焕∈RNA∷、オリゴヌクレオチド、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳∈PCR∷により栏喇されるフラグメント、第び息冯、磊们、エンドヌクレア〖ゼ侯脱第びエキソヌクレア〖ゼ侯脱のいずれかにより栏喇されるフラグメントを咐第する。乘焕尸灰は、欧脸に赂哼するヌクレオチド∈毋えばDNA第びRNA∷、唆は欧脸に赂哼するヌクレオチドの梧击挛∈毋えば欧脸に赂哼するヌクレオチドのα≥独咙佰拉挛妨∷、唆は尉荚の寥み圭わせであるモノマ〖から菇喇され评る。
≮0050≯
饯峻されたヌクレオチドは、劈喇尸において、第び/唆はピリミジン唆はプリン宾答喇尸において恃构を铜することができる。劈饯峻は、ハロゲン、アルキル答、アミン第びアジド答による1唆は剩眶のヒドロキシル答の弥垂を蜀崔し、唆は劈はエ〖テル唆はエステルとして怠墙され评る。さらに、链劈喇尸は、惟挛弄に第び排灰弄に梧击する菇陇挛、毋えばアザ≥劈第びカルボン焕劈梧击挛により弥垂さえ评る。宾答喇尸における饯峻の毋は、アルキル步されたプリン第びピリミジン、アシル步されたプリン唆はピリミジン、唆は戮の紊く梦られている剩燎茨及弥垂答を蜀崔する。
≮0051≯
乘焕モノマ〖は、ホスホジエステル冯圭唆はそのような冯圭の梧击挛により冯圭さえ评る。ホスホジエステル冯圭の梧击挛は、ホスホロチオエ〖ト、ホスホロジチオエ〖ト、ホスホロセレノエ〖ト、ホスホロジセレノエ〖ト、ホスホロアニロチオエ〖ト、ホスホラニリデ〖ト、ホスホラミデ〖ト、第び票屯のものを蜀崔する。脱胳∪乘焕尸灰∩とはまた、いわゆる、ポリアミド肩嚎に冯圭される欧脸に赂哼するか唆は饯峻された乘焕宾答を崔んで喇る∪ペプチド乘焕∩も蜀崔する。乘焕は办塑嚎唆は企塑嚎のいずれかであり评る。
≮0052≯
脱胳∪乘焕尸灰の陵输挛∩とは、陵输弄ヌクレオチド芹误、第び滦救ヌクレオチド芹误に孺秤して嫡の芹羹を铜する乘焕尸灰である。毋えば、芹误5∏ ATGCACGGG 3∏ は、5∏ CCCGTGCAT 3∏に滦して陵输弄である。
脱胳∪contig ∩とは、戮の乘焕尸灰に滦する办息の息鲁した票办の唆は陵输弄な芹误を铜する乘焕尸灰を绩す。息鲁した芹误とは、乘焕尸灰の链挛において、唆はその办婶に辫って、办年の墓さの乘焕尸灰を∪オ〖バ〖ラップ∩すると咐われる。
≮0053≯
脱胳∪教脚ヌクレオチド芹误∩とは、1唆は剩眶の教脚コドンを崔むヌクレオチドの芹误∈ポリペプチドをコ〖ドする滦救ポリヌクレオチドに孺秤して∷を绩す。教脚コドンは、ヌクレオチドの佰なったトリプレットを崔むが、しかし票じアミノ焕荒答をコ〖ドする∈すなわち、GAU第びGACトリプレットはそれぞれAspをコ〖ドする∷。
脱胳∪菇陇颁帕灰∩とは、泼年のポリペプチドの泼魔のアミノ焕の芹误に溯条されるメッセンジャ〖RNA∈mRNC∷に啪继される乘焕尸灰を咐第する。
≮0054≯
∪帽违された乘焕尸灰∩とは、栏湿のゲノムDNAに寥み哈まれない乘焕尸灰である。毋えば、嘿甩のゲノムDNAから尸违された喇墓傍灰をコ〖ドするDNA尸灰が、帽违されたDNA尸灰である。帽违された乘焕尸灰のもう1つの毋は、栏湿のゲノムに寥み哈まれない、步池弄に圭喇された乘焕尸灰である。泼年の硷から帽违された乘焕尸灰は、その硷からの厉咖挛の窗链なDNA尸灰よりも井さい。
∪乘焕尸灰菇陇挛∩とは、欧脸においては赂哼しない芹弥で寥み圭わされ、そして事弥された乘焕のセグメントを崔むようヒト拆哼を奶して饯峻された≥塑嚎唆は企塑嚎の乘焕尸灰である。
≮0055≯
∪俐觉DNA∩とは、头违5∏第び3∏第び琐眉を铜する润茨觉DNA尸灰を绩す。俐觉DNAは、誓茨DNA尸灰、毋えばプラスミドから、冠燎久步唆は湿妄弄な撬蝉により拇澜され评る。
∪陵输弄DNA∈cDNA∷∩とは、嫡啪继冠燎によりmRNA抿房から妨喇される办塑嚎DNA尸灰である。诺房弄には、mRNAの办婶に滦して陵输弄なプライマ〖は、嫡啪继の倡幌のために蝗脱される。碰度荚はまた、そのような办塑嚎DNA尸灰第びその陵输弄DNA嚎から喇る企塑嚎DNA尸灰を咐第するために脱胳∪cDNA∩を脱いる。脱胳∪cDNA∩はまた、RNA抿房から栏喇されたcDNA尸灰のクロ〖ンも咐第する。
≮0056≯
∪プロモ〖タ〖∩とは、菇陇颁帕灰の啪继を数羹づけるヌクレオチド芹误である。诺房弄には、プロモ〖タ〖は、菇陇颁帕灰の啪继倡幌婶疤に呵も夺い、颁帕灰の5∏润コ〖ドに挝拌疤弥する。啪继の倡幌において怠墙するプロモ〖タ〖柒の芹误妥燎は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド芹误により泼魔づけられる。
≮0057≯
それらのプロモ〖タ〖妥燎は、RNAポリメラ〖ゼ冯圭婶疤、TATA芹误、CAAT芹误、尸步≥泼佰弄妥燎∈DSE¨McGeheeなど., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)∷、サイクリックのAMP炳批妥燎∈CRE∷、缝蓝炳批妥燎∈SRE¨Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)∷、グルココルチコイド炳批妥燎∈GRE∷第び戮の啪继傍灰のための冯圭婶疤、毋えばCRE/ATF∈O∏Reillyなど., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)∷、AP2 (Yeなど., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP炳批妥燎冯圭タンパク剂∈CREB〃Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)∷、第びオクタマ〖傍灰∈办忍弄には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Kummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)∷を蜀崔する。プロモ〖タ〖が投券プロモ〖タ〖である眷圭、啪继の庐刨は投券恨に炳批して惧竞する。滦救弄に、啪继の庐刨は、プロモ〖タ〖が菇喇プロモ〖タ〖である眷圭、投券恨により拇泪されない。娃扩できるプロモ〖タ〖はまた梦られている。
≮0058≯
∪コアプロモ〖タ〖∩は、TATAボックス第び啪继の倡幌を蜀崔するプロモ〖タ〖怠墙のための涩寇ヌクレオチド芹误を崔む。この年盗によれば、コアプロモ〖タ〖は、宠拉を笼动し唆は寥骏泼佰弄宠拉を烧涂することができる泼年の芹误の稍哼布で浮叫できる宠拉を铜しても唆は铜さなくても紊い。
∪拇泪妥燎∩は、コアプロモ〖タ〖の宠拉を拇泪するヌクレオチド芹误である。毋えば、拇泪妥燎は、泼年の嘿甩、寥骏唆はオルガネラにおいて迫狸弄に唆は联买弄に啪继を材墙にする嘿甩傍灰と冯圭するヌクレオチド芹误を崔むことができる。それらのタイプの拇泪妥燎は奶撅、∪嘿甩≥泼佰弄∩、∪寥骏≥泼佰弄∩、唆は∪オルガネラ≥泼佰弄∩轮屯で券附される颁帕灰に冯圭されている。
∪エンハンサ〖∩は、啪继の倡幌婶疤に滦してエンハンサ〖の调违唆は芹羹に簇犯なく、啪继の跟唯を光めることができるタイプの拇泪妥燎である。
≮0059≯
∪佰硷DNA∩とは、疥年の缴肩嘿甩柒に欧脸において赂哼しない、DNA尸灰唆はDNA尸灰の礁媚を咐第する。泼年缴肩嘿甩に滦して佰硷であるDNA尸灰は、缴肩DNAが润缴肩DNA∈すなわち、嘲丸拉DNA∷と寥み圭わされる嘎り、缴肩嘿甩硷∈すなわち、柒傍拉DNA∷に统丸するDNAを崔むことができる。毋えば、啪继プロモ〖タ〖を崔んで喇る缴肩DNAセグメントに侯脱材墙に息冯されるポリペプチドをコ〖ドする润缴肩DNAセグメントを崔むDNA尸灰は、佰硷DNA尸灰であると蛔われる。嫡に咐えば、佰硷DNA尸灰は、嘲丸プロモ〖タ〖と侯脱材墙に息冯される柒傍拉颁帕灰を崔むことができる。もう1つの毋として、填栏房嘿甩に统丸する颁帕灰を崔んで喇るDNA尸灰は、そのDNA尸灰が填栏房颁帕灰を风いている仆脸恃佰嘿甩面に瞥掐される眷圭、佰硷DNAであると蛔われる。
≮0060≯
∪ポリペプチド∩とは、欧脸唆は圭喇弄に栏喇されても、ペプチド冯圭により息冯されるアミノ焕荒答のポリマ〖である。腆10改よりも警ないアミノ焕荒答のポリペプチドは奶撅、∪ペプチド∩として咐第される。
∪タンパク剂∩は、1唆は剩眶のポリペプチド嚎を崔んで喇る光尸灰である。タンパク剂はまた、润ペプチド喇尸、毋えば煤垮步湿答を崔むことができる。煤垮步湿第び戮の润ペプチド弥垂答は、タンパク剂が栏喇される嘿甩により烧裁され、そして嘿甩房により恃步するであろう。タンパク剂は、それらのアミノ焕肩嚎により塑汤嘿今において年盗され〃弥垂答、毋えば煤垮步湿答は办忍弄に、泼年されないが、しかしそれにもかかわらず、赂哼することができる。
≮0061≯
润缴肩DNA尸灰によりコ〖ドされるペプチド唆はポリペプチドは∪佰硷∩ペプチド唆はポリペプチドである。
∪寥み哈まれた颁帕灰妥燎∩とは、その妥燎がヒトによる拎侯を奶して嘿甩面に瞥掐された稿、缴肩嘿甩の厉咖挛面に寥み哈まれているDNAのセグメントである。塑券汤においては、寥み哈まれた颁帕灰妥燎は奶撅、エレクトロポレ〖ション唆は戮の祷恕により嘿甩面に瞥掐される俐觉步されたプラスミドに统丸する。寥み哈まれた颁帕灰妥燎は、傅の缴肩嘿甩からその灰鹿に奶册される。
≮0062≯
∪クロ〖ニングベクタ〖∩は、缴肩嘿甩において极围弄に剩澜する墙蜗を铜する、乘焕尸灰、毋えばプラスミド、コスミド、唆はバクテリオファ〖ジである。クロ〖ニングベクタ〖は诺房弄には、ベクタ〖の涩寇の栏湿池弄怠墙を己わないで、疯年できる轮屯で乘焕尸灰の赁掐を材墙にする1唆は警眶の扩嘎エンドヌクレア〖ゼ千急婶疤、第びクロ〖ニングベクタ〖により妨剂啪垂された嘿甩の票年第び联买への蝗脱のために努磊であるマ〖カ〖颁帕灰をコ〖ドするヌクレオチド芹误を崔む。マ〖カ〖颁帕灰は诺房弄には、テトラサイクリン卵拉唆はアンピシリン卵拉を烧涂する颁帕灰を崔む。
≮0063≯
∪券附ベクタ〖∩は、缴肩嘿甩において券附される颁帕灰をコ〖ドする乘焕尸灰である。诺房弄には、券附ベクタ〖は、啪继プロモ〖タ〖、颁帕灰第び啪继タ〖ミネ〖タ〖を崔む。颁帕灰券附は奶撅、プロモ〖タ〖の扩告布に芹弥され、そしてそのような颁帕灰はプロモ〖タ〖に∪侯脱材墙に冯圭される∩と咐われる。票屯に、拇泪妥燎第びコアプロモ〖タ〖は、拇泪妥燎がコアプロモ〖タ〖の宠拉を拇泪する眷圭、侯脱材墙に息冯される。
≮0064≯
∪寥垂え缴肩∩とは、佰硷乘焕尸灰、毋えばクロ〖ニングベクタ〖唆は券附ベクタ〖を崔む嘿甩である。塑汤嘿今においては、寥垂え缴肩の毋は、券附ベクタ〖からZtnfr12を栏喇する嘿甩である。滦救弄に、Ztnfr12は、Ztnfr12の∪欧脸富∩であり、そして券附ベクタ〖を风いている嘿甩により栏喇さえ评る。
∪インテグレイティブ寥垂え挛∩は、佰硷DNAが嘿甩ゲノムDNA面に寥み哈まれるようになる寥垂え缴肩嘿甩である。
≮0065≯
∪突圭タンパク剂∩は、警なくとも2つの颁帕灰のヌクレオチド芹误を崔んで喇る乘焕尸灰により券附されるハイブリッドタンパク剂である。毋えば、毋えば、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂は、Ztnfr12减推挛喇尸第び倘敝グロブリン喇尸を崔んで喇る。塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、∪Ztnfr12减推挛喇尸∩とは、ZTNF2唆はZTNF4の警なくとも1つを冯圭するZtnfr12减推挛の嘿甩嘲ドメインの办婶である。脱胳∪倘敝グロブリン∩とは、倘敝グロブリンの稍恃挝拌を崔んで喇るポリペプチドを咐第する。毋えば、倘敝グロブリン喇尸は、H嚎稍恃挝拌を崔んで喇る。脱胳∪Ztnfr12≥Fc∩突圭タンパク剂とは、倘敝グロブリン喇尸が倘敝グロブリンH嚎稍恃挝拌CH2第びCH3を崔んで喇る、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂を咐第する。
≮0066≯
脱胳∪减推挛∩とは、∪リガンド∩と疚する栏湿宠拉尸灰に冯圭する、嘿甩冯圭されたタンパク剂を绩す。この陵高侯脱は、嘿甩に滦するリガンドの跟蔡を拆哼する。 Ztnfr12减推挛においては、脱胳∪泼佰弄に冯圭する∩、唆は∪泼佰弄冯圭∩とは、减推挛と顶凌して冯圭するリガンドの墙蜗を咐第する。毋えば、ZTNF4はZtnfr12减推挛と泼佰弄に冯圭し、そしてこれは、浮叫材墙弄にラベルされたZTNF4とラベルされていないZTNFとの粗でのZtnfr12减推挛についての顶凌を囱弧することによって绩され评る。
≮0067≯
减推挛は、遂冯圭されたシトソ〖ル唆は乘〃モノマ〖∈毋えば、痘粒簧枫拉ホルモン减推挛、β≥アドレナリン侯脱减推挛∷唆はマルチマ〖∈毋えば、PDGF减推挛、喇墓ホルモン减推挛IL≥3减推挛、GM≥CSF减推挛、G≥CSF减推挛、エリトロポエチン减推挛第びIL≥6减推挛∷であり评る。遂冯圭された减推挛は、嘿甩嘲リガンド≥冯圭ドメイン、第び诺房弄には、シグナルトランスダクションに簇涂する嘿甩柒エフェクタ〖ドメインを崔んで喇る驴≥ドメイン菇陇により泼魔づけられる。办年の遂冯圭された减推挛においては、嘿甩嘲リガンド≥冯圭ドメイン第び嘿甩柒エフェクタ〖ドメインは、窗链な怠墙弄减推挛を崔んで喇る侍」のポリペプチドに疤弥する。
≮0068≯
办忍弄に、减推挛へのリガンドの冯圭は、嘿甩の洛颊における恃构を瞥く、嘿甩におけるエフェクタ〖ドメインと戮の尸灰との粗の陵高侯脱を苞き弹こす减推挛のコンホメ〖ション恃步をもたらす。减推挛≥リガンド陵高侯脱にしばしば息冯される洛颊附据は、颁帕灰啪继、リン焕步、忙リン焕步、サイクリックAMPを栏喇の惧竞、嘿甩カルシウムの洛颊、遂婚剂の洛颊、嘿甩烧缅、イノシト〖ル婚剂の裁垮尸豺第びリン婚剂の裁垮尸豺を蜀崔する。
≮0069≯
脱胳∪尸如シグナル芹误∩とは、それが圭喇される嘿甩の尸如烯を奶してより络きなポリペプチドを、より络きなポリペプチドの喇尸として数羹づけるペプチド∈∪尸如ペプチド∩∷をコ〖ドするDNA芹误を绩す。涟淡のより络きなポリペプチドは、尸如烯を奶しての败瓢の粗、尸如ペプチドを近殿するために奶撅尸豺される。
≮0070≯
∪帽违されたポリペプチド∩は、兵厉拉嘿甩喇尸、毋えば煤垮步湿、婚剂唆は欧脸においてポリペプチドに簇息している戮のタンパク剂拉稍姐湿を悸剂弄に崔まないポリペプチドである。诺房弄には、帽违されたポリペプチドの拇澜湿は、光く篮澜された妨で、すなわち警なくとも腆80◇の姐刨、警なくとも腆90◇の姐刨、警なくとも腆95◇の姐刨、95◇笆惧の姐刨、唆は99◇笆惧の姐刨でポリペプチドを崔む。泼年のタンパク剂拇澜湿が帽违されたポリペプチドを崔むことを绩すための1つの缄檬は、タンパク剂拇澜湿のドデシル尾焕ナトリウム∈SDS∷≥ポリアクリルアミドゲル排丹彼瓢第びゲルのク〖マシ〖ブル〖厉咖によるシングルバンドの叫附によるものである。しかしながら、脱胳∪帽违された∩とは、戮の湿妄妨、毋えばダイマ〖唆は戮のグリコシル步された唆は投瞥挛步された妨での票じポリペプチドの赂哼を怯近しない。
≮0071≯
脱胳∪アミノ≥琐眉∩第び∪カルボキシル≥琐眉∩とは、ポリペプチド柒の疤弥を绩すために塑汤嘿今において蝗脱される。その攫斗が材墙である眷圭、それらの脱胳は、儡夺拉唆は陵滦弄疤弥を绩すためにポリペプチドの泼年の芹误唆は办婶に簇して蝗脱される。毋えば、ポリペプチド柒の滦据芹误のカルボキシル琐眉娄に疤弥する办年の芹误は、その滦救芹误のカルボキシル琐眉に钨儡して疤弥するが、しかし窗链なポリペプチドのカルボキシル琐眉では涩ずしも涩妥ではない。
≮0072≯
脱胳∪券附∩とは、颁帕灰栏喇湿の栏圭喇を咐第する。毋えば、菇陇颁帕灰においては、券附はmRNAへの菇陇颁帕灰の啪继第び1唆は剩眶のポリペプチドへのmRNAの溯条を蜀崔する。
≮0073≯
脱胳∪スプライス恃佰挛∩とは、颁帕灰から啪继されるRNAの企荚买办の妨を绩すために、塑汤嘿今において蝗脱される。スプライス恃佰は、啪继されたRNA尸灰柒の、唆は奶撅你いが、侍」に啪继されたRNA尸灰粗の企荚买办のスプライシング婶疤の蝗脱を奶して欧脸において栏じ、そして票じ颁帕灰から啪继されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス恃佰挛は、恃构されたアミノ焕芹误を铜するポリペプチドをコ〖ドすることができる。脱胳スプライス恃佰挛はまた、颁帕灰から啪继されるmRNAのスプライス恃佰挛によりコ〖ドされるポリペプチドを绩すために塑汤嘿今において蝗脱される。
≮0074≯
塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、脱胳∪イムノモジュレ〖タ≥∩とは、サイトカイン、创嘿甩喇墓傍灰、リンフォトキシン、票箕≥簧枫尸灰、陇缝傍灰第びそれらの尸灰の圭喇梧击挛を蜀崔する。
≮0075≯
脱胳∪陵输挛】钩≥陵输挛滦∩とは、努磊な掘凤布で、润鼎铜弄に柴圭される奥年した滦を妨喇する润票办拉喇尸を绩す。毋えば、ビオチン第びアビジン(唆はストレプタビジン)は、陵输挛】钩≥陵输挛滦の答塑房メンバ〖である。戮の诺房弄な陵输挛】钩≥陵输挛滦は、减推挛】リガンド滦、钩挛】钩付(唆はハプテン唆はエピト〖プ)滦、センス】アンチセンス ポリヌクレオチド滦、第び票屯のものを蜀崔する。陵输挛】钩≥陵输挛滦の鲁く豺违が疥司される眷圭、その陵输挛】钩≥陵输挛滦は攻ましくは、°109M-1の冯圭科下拉を铜する。
≮0076≯
∪钩≥イディオタイプ钩挛∩とは、倘敝グロブリンの材恃挝拌ドメインと冯圭する钩挛である。塑汤嘿今においては、钩≥イディオタイプの钩挛は、钩≥Ztnfr12钩挛の材恃挝拌と冯圭し、そして骄って、钩≥イディオタイプ钩挛はZtnfr12のエピト〖プを滔曙する。
∪钩挛フラグメント∩は、钩挛の办婶、毋えばF(ab∏)2, F(ab)2, Fab∏, Aab第び票屯のものである。菇陇に簇犯なく、钩挛フラグメントは、禄なわれていない钩挛により千急される票じ钩付と冯圭する。毋えば、钩≥Ztnfr12モノクロ〖ナル钩挛フラグメントは、Ztnfr12のエピト〖プと冯圭する。
≮0077≯
脱胳∪钩挛フラグメント∩はまた、泼年の钩付に冯圭する、圭喇の唆は颁帕弄に菇蜜されたポリペプチド、毋えばL嚎材恃挝拌から喇るポリペプチド、H第びL嚎の材恃挝拌から喇る∪Fv∩フラグメント、L第びH嚎材恃挝拌がペプチドリンガ〖により息冯されている寥垂え办塑嚎ポリペプチド尸灰∈∪svFvタンパク剂∩∷、第び亩材恃挝拌を滔曙するアミノ焕荒答から喇る呵警千急帽疤を蜀崔する。
∪キメラ钩挛∩は、喻货瓢湿钩挛に统丸する硷」のドメイン第び陵输弄疯年挝拌を崔む寥垂えタンパク剂であるが、ところが钩挛尸灰の荒りはヒト钩挛に统丸する。
≮0078≯
∪ヒト步钩挛∩は、モノクロ〖ナル钩挛のネズミ陵输弄疯年挝拌がネズミ倘敝グロブリンのH第びL材恃嚎からヒト材恃ドメインに败乖されている寥垂えタンパク剂である。
塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、∪迹闻恨∩は、迹闻のために铜脱である儡圭挛を栏喇するために钩挛喇尸に儡圭される尸灰唆は付灰である。迹闻恨の毋は、挑恨、魄燎、イムノモジュレ〖タ〖、キレ〖ト步恨、怙燎步圭湿、各宠拉恨唆は厉瘟、第び庶纪栏票疤挛を蜀崔する。
∪浮叫できるラベル∩は、壳们のために铜脱な尸灰を栏喇するために钩挛喇尸に儡圭され评る尸灰唆は付灰である。浮叫できるラベルの毋は、キレ〖ト步恨、各宠拉恨、庶纪拉票疤挛、分各恨、撅姬拉イオン唆は戮のマ〖カ〖喇尸を蜀崔する。
≮0079≯
∪科下拉筛急∩とは、妈2ポリペプチドの篮澜唆は浮叫を捏丁し、唆は答剂への妈2ポリペプチドの冯圭のための婶疤を丁惦するために、妈2ポリペプチドに冯圭され评るポリペプチドセグメントを绩すために塑汤嘿今において蝗脱される。肩に、钩挛唆は、戮の泼佰弄冯圭恨が网脱できるいずれかのペプチド唆はタンパク剂が科下拉筛急として蝗脱され评る。科下拉筛急は、ポリ≥ヒスチジン废、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンS トランスフェラ〖ゼ∈Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988∷, Glu-Glu科下拉筛急 ∈Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985∷, 湿剂P、すなわちFlagTM ペプチド∈Hoppなど., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988∷、ストレプタビジン冯圭ペプチド、唆は戮の钩付拉エピト〖プ唆は冯圭ドメインを蜀崔する。
≮0080≯
办忍弄に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を徊救のこと。科下拉筛急をコ〖ドする乘焕尸灰は、睛墒丁惦荚∈毋えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA∷から掐缄できる。
≮0081≯
∪顽の钩挛∩は、钩挛フラグメントに滦惟するものとして、迹闻恨により儡圭されない窗链な钩挛である。顽の钩挛は、ポリクロ〖ナル第びモノクロ〖ナル钩挛、事びに办年の寥垂え钩挛、毋えばキメラ拉第びヒト步钩挛を蜀崔する。
∪企泼佰弄钩挛∩とは、帽办钩挛尸灰柒に2硷の佰なった钩付のための冯圭婶疤を铜する。
∪驴泼佰弄钩挛寥喇湿∩とは、2硷の佰なった钩挛のための冯圭婶疤を铜する钩挛喇尸を崔んで喇る。毋えば、驴泼佰弄钩挛寥喇湿は企泼佰弄钩挛喇尸を崔んで喇ることができ、唆は驴泼佰弄钩挛寥喇湿は、佰なった钩付と冯圭する警なくとも2硷の钩挛喇尸を崔んで喇ることができる。
≮0082≯
塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、脱胳∪钩挛喇尸∩は、窗链な钩挛第び钩挛フラグメントの尉荚を蜀崔する。
∪倘敝儡圭挛∩は、迹闻恨唆は浮叫できるラベルと钩挛喇尸との儡圭挛である。
塑券汤において蝗脱される眷圭、脱胳∪钩挛突圭タンパク剂∩とは、钩挛喇尸第びZtnfr12ポリペプチド喇尸を崔んで喇る寥垂え尸灰を咐第する。钩挛突圭タンパク剂の毋は、Ztnfr12嘿甩ドメイン、第びFcドメイン唆は钩付≥冯圭挝拌のいずれかを崔んで喇るタンパク剂を蜀崔する。
≮0083≯
∪筛弄ポリペプチド∩唆は∪筛弄ペプチド∩は、警なくとも1つのエピト〖プを崔み、そして筛弄嘿甩、毋えば拣徵嘿甩、唆は炊厉恨钩付を么积する嘿甩惧で券附されるアミノ焕芹误である。T嘿甩は、筛弄ポリペプチド唆は筛弄ペプチドに、肩妥寥骏努圭拉剩圭挛尸灰により捏丁されるペプチドエピト〖プを千急し、そして诺房弄には、筛弄嘿甩を拖豺し、唆は筛弄嘿甩の毋に戮の倘敝嘿甩を输郊し、それにより筛弄嘿甩を沪巢する。
≮0084≯
∪钩付拉ペプチド∩は、T嘿甩により千急されるMHC≥ペプチド剩圭挛を妨喇するために、肩妥寥骏努圭剩圭挛尸灰を冯圭し、それにより、T嘿甩への捏丁に答づいて嘿甩魄拉リンパ靛炳批を投券するペプチドである。骄って、钩付拉ペプチドは、努磊な肩妥寥骏努圭拉剩圭挛尸灰に冯圭し、そして嘿甩魄拉T嘿甩炳批、毋えば钩付を冯圭するか唆は券附する筛弄嘿甩に滦する嘿甩拖豺唆は泼佰弄サイトカイン倡庶を投券することができる。钩付拉ペプチドは、钩付捏丁嘿甩唆は筛弄嘿甩惧に、クラスI唆はクラスII肩妥寥骏努圭拉剩圭挛尸灰に簇して冯圭され评る。
≮0085≯
靠乘栏湿においては、RNAポリメラ〖ゼIIは、mRNAを栏喇するために菇陇颁帕灰の啪继を卡寝する。乘焕尸灰はRNAポリメラ〖ゼII抿房を崔むより措茶され、ここでRNA啪继挛は泼年のmRNAの芹误に滦して陵输弄である芹误を铜する。RNA啪继挛は、∪アンチセンスRNA∩と钙ばれ、そしてアンチセンスRNAをコ〖ドする乘焕尸灰は∪アンチセンス颁帕灰∩と钙ばれる。アンチセンスRNA尸灰は、mRNA尸灰に冯圭することができ、mRNA溯条の了巢をもたらす。
≮0086≯
∪Ztnfr12に滦して泼佰弄なアンチセンスオリゴヌクレオチド∩唆は∪Ztnfr12アンチセンスオリゴヌクレオチド∩は、∈a∷Ztnfr12颁帕灰の办婶と鼎に奥年した话翁挛を妨喇できるか、唆は∈b∷Ztnfr12颁帕灰のmRNA啪继挛の办婶と鼎に奥年した企翁挛を妨喇できる芹误を铜するオリゴヌクレオチドである。
∪リボザイム∩は、卡寝面看を崔む乘焕尸灰である。この脱胳は、RNA冠燎、极甘スプライシングRNA、极甘尸豺拉RNA第びそれらの卡寝怠墙を乖う乘焕尸灰を蜀崔する。
∪嘲婶捌柒芹误∩∈external guide sequence∷は、嘿甩柒mRNAの泼年硷に柒傍拉リボザイム、すなわちRNア〖ゼPを数羹づけ、RNア〖ゼPによるmRNAの尸豺をもたらす乘焕尸灰である。嘲婶捌柒芹误をコ〖ドする乘焕尸灰は、∪嘲婶捌柒芹误颁帕灰∩と钙ばれる。
≮0087≯
脱胳∪恃佰挛Ztnfr12颁帕灰∩は、芹误戎规2の饯峻であるアミノ焕芹误を铜するポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰を咐第する。そのような恃佰挛は、欧脸に赂哼する驴房附据のZtnfr12颁帕灰、第び芹误戎规2のアミノ焕芹误の瘦赂拉アミノ焕弥垂を崔む圭喇颁帕灰を蜀崔する。Ztnfr12颁帕灰の纳裁の恃佰挛妨は、塑汤嘿今に淡很されるヌクレオチド芹误の赁掐唆は风己を崔む乘焕尸灰である。恃佰挛Ztnfr12颁帕灰は、その颁帕灰が芹误戎规1のヌクレオチド芹误を铜する乘焕尸灰、唆はその输挛と、钝教掘凤布でハイブリダイズするかどうかを疯年することによって票年され评る。
≮0088≯
戮数では、恃佰挛Ztnfr12颁帕灰は、芹误≥孺秤により票年さえ评る。2つのアミノ焕芹误は、その2つのアミノ焕芹误のアミノ焕荒答が、呵络の炳批により腊误される眷圭、票じである眷圭、∪100◇のアミノ焕芹误票办拉∩を铜する。芹误孺秤は、筛洁のソフトウェアプログラム、毋えばDNASTAR∈Madison, Wisconsin∷により澜陇されるLASERGENE栏湿攫鼠コンピュ〖タ〖サイトに蜀崔されるそれらのプログラムを脱いて乖われ评る。
≮0089≯
呵努な腊误を疯年することによって、2つのヌクレオチド唆はアミノ焕芹误を孺秤するための戮の数恕は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu など. (eds.), ∪Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins.∩ In Methods in Gene Biotechnology, Pages 123-151 (CRC Press. Inc. 1997), 第びBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) を徊救のこと∷。芹误票办拉を疯年するための泼年の数恕は布淡に淡很される。
≮0090≯
恃佰挛Ztnfr12颁帕灰唆は恃佰挛Ztnfr12ポリペプチド、恃佰挛颁帕灰唆はそれによりコ〖ドされるポリペプチドは、钩≥Ztnfr12钩挛に滦して泼佰弄に冯圭する墙蜗、ZTNF4を泼佰弄に冯圭する墙蜗、唆はZTNF4を泼佰弄に冯圭するが、しかしZTNF2を泼佰弄に冯圭しない墙蜗により怠墙弄に泼魔づけられる。
≮0091≯
脱胳∪滦惟颁帕灰恃佰挛∩とは、票じ厉咖挛颁帕灰郝を狸める颁帕灰の剩眶の颁帕灰の企荚买办妨のいずれかを绩すために、塑汤嘿今において蝗脱される。滦惟颁帕灰恃佰は、仆脸恃佰を奶して欧脸では栏じ、そして礁媚柒の山附房驴房附据をもたらすことができる。颁帕灰仆脸恃佰は、サイレントであり(コ〖ドされたポリペプチドにおける恃步がない)、唆は恃构されたアミノ焕芹误を铜するポリペプチドをコ〖ドすることができる。脱胳、滦惟颁帕灰恃佰挛はまた、颁帕灰の滦惟颁帕灰恃佰挛によりコ〖ドされるタンパク剂を绩すために塑汤嘿今において蝗脱される。
≮0092≯
脱胳∪オルト挛∈orthology∷∩とは、佰なった硷からのポリペプチド唆はタンパク剂の怠墙弄陵滦湿である、1つの硷から评られるポリペプチド唆はタンパク剂を绩す。オルト挛粗の芹误の汗佰は、泼年步の冯蔡である。
∪パラ挛∈paralogs∷∩とは、栏湿によって澜陇される、佰なっているが·しかし菇陇弄に簇息するタンパク剂である。パラ挛は、颁帕灰脚剩を奶して栏じると蛔われる。毋えば、α≥グロビン、β≥グロビン第びミオグロビンは、お高いパラ挛である。
≮0093≯
塑券汤は、Ztnfr12颁帕灰の怠墙弄フラグメントを蜀崔する。塑券汤においては、Ztnfr12颁帕灰の∪怠墙弄フラグメント∩は、塑汤嘿今に淡很されるドメインであるZtnfr12ポリペプチドの办婶をコ〖ドする乘焕尸灰を咐第するか、唆は钩≥Ztnfr12钩挛に滦して泼佰弄に冯圭する墙蜗、ZTNF4を泼佰弄に冯圭する墙蜗、第びZTNF4を泼佰弄に冯圭するが、しかしZTNF2を泼佰弄に冯圭しない墙蜗により怠墙弄に泼魔づけられる。
筛洁尸老恕の稍赖澄さのために、ポリマ〖の尸灰翁第び墓さは、おおよその猛であることが妄豺される。そのような猛が∪腆∩X唆は∪およそ∩Xとして山される眷圭、Xの咐第された猛は、∞10◇で赖澄であると妄豺されるであろう。
≮0094≯
3ˉZtnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰の栏喇
ヒトZtnfr12颁帕灰をコ〖ドする乘焕尸灰は、芹误戎规1第び9に答づいてのポリヌクレオチドプロ〖ブを脱いて、ヒトcDNA唆はゲノムライブラリ〖をスクリ〖ニングすることによって评られる。それらの祷恕は、筛洁であり、そして浇尸に澄惟されている。
≮0095≯
毋绩されるように、ヒトZtnfr12颁帕灰をコ〖ドする乘焕尸灰は、ヒトcDNAライブラリ〖から帽违され评る。この眷圭、妈1檬超は、碰度荚に紊く梦られている数恕を脱いて、毋えば骢面看B-嘿甩唆はリンパ泪寥骏からRNAを帽违することによって、cDNAライブラリ〖を拇澜することである。办忍弄に、RNA帽违祷恕は、嘿甩を尸豺するための数恕、RNAのRNア〖ゼ回哭された尸豺を了巢するための缄檬、第びDNA、タンパク剂第び驴劈梧兵厉湿からRNAを尸违する数恕を捏丁すべきである。
≮0096≯
毋えば、链RNAは、闭挛免燎において寥骏を培冯し、その培冯された寥骏を讫克第び讫死により蚀赫し、嘿甩を拖豺し、フェノ〖ル/クロロホルムの拖闭により涟淡蚀赫された寥骏を藐叫し、タンパク剂を近き、そして宾步リチウムによる联买弄睦怕によりRNAを荒る稍姐湿から尸违することによって帽违され评る∈毋えば、Ausubel など., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition pages4-1×4-6 (John Wiley& Sons 1995 )[∪Ausubel (1995)∩]; Wuなど., Methods in Gene Biotechnology, pages33-41 (CRC Press, Inc. 1997 ) [∪Wu(1997)∩]を徊救のこと∷。
≮0097≯
戮数では、链RNAは、蚀赫された寥骏をグアニジニウムイソチオシアネ〖トにより藐叫し、铜怠拖寝により藐叫し、そしてRNAを兵厉湿から绩汗斌看尸违により尸违することによって帽违され评る∈毋えば、Chirgwinなど., Biochemistry 18: 52 (1979); Ausubel (1995) P.4-1×4-6; Wu (1997) P.33-41 を徊救のこと∷。
≮0098≯
cDNAライブラリ〖を菇喇するために、ポリ(A)+RNAが链RNA拇澜湿から帽违されるべきである。ポリ(A)+RNAは、オリゴ∈dT∷≥セルロ〖スクロマトグラフィ〖の筛洁祷恕を脱いて、链RNAから帽违され评る∈毋えば、Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad.Sci. USA69: 1408 (1972); Ausubel (1995) P. 4-11×4-12を徊救のこと∷。
≮0099≯
企塑嚎cDNA尸灰は、碰度荚に紊く梦られている祷恕を脱いて、ポリ(A)+RNAから圭喇される∈毋えば、Wu (1997) P.41-46を徊救のこと∷。さらに、辉任のキットが、企塑嚎cDNA尸灰を圭喇するために蝗脱され评る。毋えば、そのようなキットは、Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) 第びSTRATAGENE (La Jolla, CA) から掐缄できる。
≮0100≯
硷」のクロ〖ニングベクタ〖が、cDNAライブラリ〖の菇喇のために努磊である。毋えば、cDNAライブラリ〖は、バクテリオファ〖ジに统丸するベクタ〖、毋えばλgt10バクタ〖において拇澜され评る。毋えば、Huynhなど., ∪Construction and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λ11∩ in DNA Cloning: A Practica Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) at pages 47-52 を徊救のこと。
≮0101≯
戮数では、企塑嚎cDNA尸灰は、プラスミドベクタ〖、毋えばPBLUESCRIPTベクタ〖∈STRATAGENE〃La Jolla, CA∷, LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) 唆は戮の辉任のベクタ〖面に赁掐され评る。努磊なクロ〖ニングベクタ〖はまた、American Type Culture Collection (Manassas. VA) から掐缄できる。
クロ〖ン步されたcDNA尸灰を笼升するために、cDNAライブラリ〖が、筛洁祷恕を脱いて、付乘缴肩面に赁掐される。毋えば、cDNAライブラリ〖は、毋えばLife Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) から评られるコンピテントE.コリDH5嘿甩面に瞥掐され评る。
≮0102≯
ヒトゲノムライブラリ〖は、碰度肠において紊く梦られている缄檬により拇澜され评る∈毋えばAusubel (1995) p. 5-1×5-6; Wu (1997) p. 307-327を徊救のこと∷。ゲノムDNAは、肠烫宠拉恨Sarkosylにより寥骏を拖豺し、その拖豺湿をプロテイナ〖ゼKにより久步し、稍拖拉荒臣を拖豺湿から斌看尸违により蓝爵し、イソプロパノ〖ルを脱いて拖豺湿から乘焕を睦怕し、そして宾步セシウム泰刨グラジエント惧で浩伏蛮されたDNAを篮澜することによって帽违され评る。
≮0103≯
ゲノムライブラリ〖の栏喇のために努磊であるDNAフラグメントは、ゲノムDNAのランダム羊们により、唆は扩嘎エンドヌクレア〖ゼによるゲノムDNAの婶尸久步により评られる。ゲノムDNAフラグメントは、骄丸の祷恕、毋えば努磊な琐眉を丁惦するために扩嘎冠燎久步の蝗脱、DNA尸灰の疥司しない息冯を搀闰するためにアルカリホスファタ〖ゼ借妄の蝗脱、第び努磊がリガ〖ゼによる息冯に骄って、ベクタ〖、毋えばバクテリオファ〖ジ唆はコスミドベクタ〖面に赁掐され评る。そのような拎侯のための祷恕は碰度肠において紊く梦られている∈毋えば、Ausubel (1995) p. 5-1×5≥6; Wu (1997) p. 307-327 を徊救のこと∷。
≮0104≯
戮数では、ゲノムライブラリ〖は、辉任富、毋えばResearch Genetic (Huntsville, AL) 第びATCC (Marassas, VA) から评られる。
cDNA唆はゲノムクロ〖ンを崔むライブラリ〖は、筛洁数恕を脱いて、芹误戎规1第び4に答づかれる1唆は剩眶のポリヌクレオチドプロ〖ブによりスクリ〖ンされ评る∈毋えば、Ausubel (1995) p. 6-1×6-11を徊救のこと∷。
≮0105≯
ヒトZtnfr12颁帕灰をコ〖ドする乘焕尸灰はまた、塑汤嘿今に淡很されるように、Ztnfr12颁帕灰のヌクレオチド芹误に答づくヌクレオチド芹误を铜するオリゴヌクレオチドプライマ〖によるポリメラ〖ゼ嚎瓤炳∈PCR∷を脱いて评られる。PCRによるライブラリ〖のスクリ〖ニングの办忍弄数恕は、毋えば、Yuなど., ∪Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries∩. In Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), p.211-215 (Humana Press, Inc. 1993)により捏丁される。
≮0106≯
さらに、簇息する颁帕灰を帽违するためへのPCRの蝗脱の祷恕は、毋えばPreston, ∪Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members,∩ in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols; Current Metods and Applications. White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993) により淡很される。
≮0107≯
布淡のようにして栏喇された钩≥Ztnfr12钩挛はまた、cDNAライブラリ〖からのZtnfr12颁帕灰をコ〖ドするDNA芹误を帽违するためにも蝗脱され评る。毋えば、钩挛はλgt11券附ライブラリ〖をスクリ〖ンするために蝗脱され、唆は钩挛はハイブリッド联买第び溯条に鲁くイムノスクリ〖ニングのために蝗脱され评る∈毋えば、Ausubel∈1995∷p.6-12×6-16; Margolis など., ∪Screening λ expression libraries with untibody and Protein Probes∩ in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など (eds.) p. 1-14 (Oxford University Press 1995) を徊救のこと∷。
≮0108≯
戮に、Ztnfr12颁帕灰は、お高いプライムする墓いオリゴヌクレオチド、第び塑汤嘿今に淡很されるヌクレオチド芹误を脱いて、乘焕尸灰を圭喇することによって评られる∈毋えば、Ausubel (1995) p.8-8×8-9を徊救のこと∷。ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いての澄惟された祷恕は、警なくとも2kbの墓さのDNA尸灰を圭喇する墙蜗を捏丁する∈Adang など., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993). Bambot など., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dilfon など., ∪Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constrauction of Synthetic Genes,∩ in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. White (ed.), Pages 263-268. (Humana Press. Inc. 1993), 第びHolowachukなど., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)∷。
≮0109≯
塑券汤の乘焕尸灰はまた、ホスホラミジット数恕のようなプロトコ〖ルを脱いて、∪颁帕灰怠柴∩により圭喇され评る。步池弄に圭喇される企塑嚎DNAが颁帕灰唆は颁帕灰フラグメントの圭喇のような脱庞のために涩妥とされる眷圭、改」の陵输弄嚎は侍」に澜陇される。没い颁帕灰∈60×80の宾答滦∷の栏喇は祷窖弄に词帽であり、そして陵输弄嚎を圭喇し、そして肌にそれらをアニ〖リングすることによって茫喇され评る。しかしながら、墓い颁帕灰∈300笆惧の宾答滦∷の栏喇に簇しては、步池弄DNA圭喇の粗、改」のサイクルのカップリング跟唯はめったに100◇ではないので、泼检な缄檬が涩妥とされる。
≮0110≯
この啼玛を诡绳するために、圭喇颁帕灰∈企塑嚎∷が、20×100改の墓さのヌクレオチドである办塑嚎フラグメントからモジュラ〖妨でアセンブルされる。ポリヌクレオチド圭喇の浩雇のためには、毋えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura など., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), などClimie など., Proc. Nat∏l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990) を徊救のこと。
≮0111≯
Ztnfr12 cDNA唆はZtnfr12ゲノムフラグメントの芹误は、筛洁の数恕を脱いて疯年され评る。塑汤嘿今に倡绩されるZtnfr12ポリヌクレオチド芹误はまた、Ztnfr12颁帕灰の5∏娄の润≥コ〖ド挝拌をクロ〖ン步するためのプロ〖ブ唆はプライマ〖として蝗脱され评る。Ztnfr12颁帕からのプロモ〖タ〖妥燎は、毋えばリンパ泪寥骏、毋えばトランスジェニック瓢湿、唆は颁帕灰迹闻を减けている吹荚において佰硷颁帕灰の券附を数羹づけるために蝗脱され评る。そのようなプロモ〖タ〖妥燎は、芹误戎规9のヌクレオチド1≥1000のうち50, 100, 200, 400唆は600改のヌクレオチドから喇るフラグメントにより捏丁され评る。戮数では、Ztnfr12颁帕灰プロモ〖タ〖は、芹误戎规9のヌクレオチド1≥1000により捏丁され评る。Ztnfr12プロモ〖タ〖唆は拇泪妥燎を崔むゲノムフラグメントの票年は、浇尸に澄惟された祷恕、毋えば风己尸老を脱いて茫喇され评る∈办忍弄には、Ausubel (1995) を徊救のこと∷。
≮0112≯
5∏娄フランギング芹误のクロ〖ニングはまた、アメリカ泼钓妈5,641,670规に倡绩される数恕に骄って、∪颁帕灰宠拉步∩によるZtnfr12タンパク剂の栏喇を楼渴する。缄没くに咐第すれば、嘿甩における柒傍拉Ztnfr12颁帕灰の券附は、警なくとも筛弄芹误、拇泪芹误、エキソン、第び滦になっていないスプライスドナ〖婶疤を崔んで喇るDNA菇陇挛を、Ztnfr12颁帕灰郝面に瞥掐することによって恃构される。筛弄芹误は、柒傍拉Ztnfr12颁帕灰郝を铜する菇陇挛の陵票寥垂えを材墙にするZtnfr12 5∏娄润コ〖ド芹误であり、それにより、涟淡菇陇挛柒の芹误は柒傍拉Ztnfr12コ〖ド芹误により侯脱材墙に息冯されるようになる。この眷圭、柒傍拉Ztnfr12プロモ〖タ〖が、戮の拇泪は误により弥垂されるか唆はそれにより输郊され、笼动された寥骏泼佰弄、唆は戮数では、拇泪された券附が捏丁される。
≮0113≯
4ˉZtnfr12恃佰挛の栏喇
塑券汤は、塑汤嘿今に倡绩されるZtnfr12ポリペプチドをコ〖ドする硷」の乘焕尸灰、毋えばDNA第びRNA尸灰を捏丁する。碰度荚は、颁帕灰コ〖ドの教脚の囱爬から、陵碰の芹误恃瓢がそれらのポリヌクレオチド尸灰粗で材墙であることを推白に千急するであろう。芹误戎规3は、それぞれ芹误戎规2のZtnfr12ポリペプチドをコ〖ドするすべての乘焕尸灰を蜀崔する教脚ヌクレオチド芹误である。碰度荚は、芹误戎规3の教脚芹误がまた、Tに洛わってUを弥垂することによって、それぞれ芹误戎规2をコ〖ドするすべてのRNA芹误を捏丁することを千急するであろう。骄って、塑券汤は、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578、第びそれらのRNA票霹湿を崔んで喇るZtnfr12ポリペプチド≥コ〖ド乘焕尸灰を措茶する。
≮0114≯
山2は、教脚ヌクレオチド疤弥を绩すために、芹误戎规3柒に蝗脱される1矢机コ〖ドを绩す。∪豺∩は、コ〖ド矢机により绩されるヌクレオチドである。∪陵输挛∩とは、陵输弄ヌクレオチドのためのコ〖ドを绩す。毋えば、コ〖ドYはC唆はTのいずれかを绩し、そしてその输挛RはA唆はGを绩し、AはTに滦して陵输弄であり、そしてGはCに滦して陵输弄である。
≮0115≯
≮山2≯


≮0116≯
疥年のアミノ焕についてのすべての材墙なコドンを蜀崔する、芹误戎规3に蝗脱される教脚コドンが山3に绩される。
≮0117≯
≮山3≯


≮0118≯
碰度荚は、いくらかのあいまいさが、改」のアミノ焕をコ〖ドするすべての材墙なコドンの洛山である教脚コドンの疯年において瞥掐されることを妄豺するであろう。毋えば、セリン∈WSN∷のための教脚コドンは、ある茨董布で、アルギニン∈AGR∷をコ〖ドすることができ、そしてアルギニン∈MGN∷のための教脚コドンは、ある茨董布で、セリン∈AGY∷をコ〖ドすることができる。梧击する簇犯が、フェニルアラニン第びロイシンをコ〖ドするコドン粗に赂哼する。骄って、教脚芹误により蜀崔されるいくつかのポリヌクレオチドは、恃佰挛アミノ焕芹误をコ〖ドすることができるが、しかし碰度荚は、芹误戎规2のアミノ焕芹误への徊救によりそのような恃佰挛芹误を推白に票年することができる。恃佰挛芹误は、塑汤嘿今に淡很のようにして幢墙拉について推白に活赋され评る。
≮0119≯
佰なった硷は∪联买弄コドン蝗脱恕∩を绩すことができる。办忍弄には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893≥912, 1980; Haas, など., Curr. Biol. 6: 315≥24, 1996; Wain≥Hobson、など.,Gene 13¨355≥64·1981〃Grosjean and Fiera·Gene 18¨199≥209、1982〃Holm,NucˉAcids Resˉ14¨3075≥87、1986〃Ikemura·JˉMolˉBiolˉ158¨573≥97·1982、Sharyp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494(1995), 第びMakrides, Microbiol. Rev. 60: 512(1996) を徊救のこと。
≮0120≯
塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、脱胳、∪联买弄コドン蝗脱恕∩唆は∪联买弄コドン∩とは、办年の硷の嘿甩に呵も裳人に蝗脱され、骄って改」のアミノ焕をコ〖ドする材墙なコドンの1唆は警眶の洛山を攻むタンパク剂溯条コドンを咐第する祷窖弄脱胳である(山2を徊救のこと)。毋えば、アミノ焕トレオニン∈Thr∷は、ACA、ACC、ACG、唆はACTによりコ〖ドされるが、しかし赢讫梧嘿甩においては、ACCが呵も奶撅に蝗脱されるコドンであり〃戮の硷においては、毋えば韩妙嘿甩、冠熟、ウィルス唆は嘿遁においては、佰なったThrコドンが攻ましい。
≮0121≯
泼年の硷のための联买弄コドンは、碰度肠において梦られている硷」の数恕により、塑券汤のポリヌクレオチド面に瞥掐され评る。毋えば、寥垂えDNA面への联买弄コドン芹误の瞥掐は、泼年の嘿甩房唆は硷柒でタンパク剂の溯条により跟蔡弄にすることによって、そのタンパク剂の栏喇を笼动する。骄って、芹误戎规3に倡绩される教脚コドン芹误は、碰度肠において奶撅蝗脱され、そして塑汤嘿今において倡绩される硷」の嘿甩房第び硷においてポリペプチドの券附を呵努步するための抿房として侯脱する。联买コドンを崔む芹误は、硷」の硷における券附について活赋され、そして塑汤嘿今に倡绩される幢墙拉について活赋され评る。
≮0122≯
塑券汤はさらに、戮の硷∈オルト挛∷からの陵滦湿を山すポリペプチド第び乘焕尸灰を丁惦する。それらの硷は、赢讫梧、幕梧、尉拉梧、ハ妙梧、蝶梧、韩妙第び戮の涝那第び痰涝那瓢湿硷を蜀崔するが、芒しそれらだけには嘎年されない。毋绩のように、芹误戎规12, 13第び14は、それぞれネズミZtnfr12のヌクレオチド、アミノ焕第び缴肩ヌクレオチド芹误を捏丁する。ネズミZtnfr12ポリペプチドの泼魔は、芹误戎规13のアミノ焕荒答1≥69での嘿甩嘲ドメイン、芹误戎规13のアミノ焕荒答70≥96でのトランスメンブランドメイン、芹误戎规13のアミノ焕荒答97≥175での嘿甩柒ドメイン、第び芹误戎规13のアミノ焕荒答21≥138でのcysに少んでいる挝拌を蜀崔する。
≮0123≯
泼に督蹋あるものは、戮の赢讫梧硷、毋えばネズミ、ブタ、陀、ウシ、袱、ネコ、窍第び戮の晤墓梧リガンドからのZtnfr12ポリペプチドである。ヒトZtnfr12ポリペプチドのオルト挛は、骄丸のクロ〖ニング祷恕と寥圭して、塑券汤により丁惦される攫鼠第び寥喇湿を脱いてクロ〖ン步され评る。毋えば、Ztnfr12 cDNAは、Ztnfr12を券附する寥骏唆は嘿甩房から评られるmRNAを脱いてクロ〖ン步され评る。mRNAの努磊な富は、塑汤嘿今に倡绩される芹误から措茶されたプロ〖ブによりノザンブロットをプロ〖ブすることによって票年され评る。肌に、ライブラリ〖が哇拉の寥骏唆は嘿甩废のmRNAから拇澜される。
≮0124≯
Ztnfr12コ〖ドのcDNAが硷」の数恕、毋えば窗链な唆は婶尸弄なcDNAにより、唆は涟淡倡绩される芹误に答づく1唆は剩眶の恃拉プロ〖ブにより、プロ〖ブすることによって帽违され评る。cDNAはまた、塑汤嘿今に倡绩される洛山弄なZtnfr12芹误から措茶されたプライマ〖を脱いて、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いてもクロ〖ン步され评る。さらに、cDNAライブラリ〖が、缴肩嘿甩を妨剂啪垂し、唆はトランスフェクトするために蝗脱され、そして督蹋あるcDNAの券附がZtnfr12ポリペプチドに滦する钩挛により浮叫され评る。
≮0125≯
碰度荚は、芹误戎规1に倡绩される芹误がヒトZtnfr12の帽办の滦惟颁帕灰を山し、そして滦惟颁帕灰恃瓢第び蛤高のスプライシングが栏じることが徒卢されることを千急するであろう。塑汤嘿今に倡绩されるヌクレオチド芹误の滦惟颁帕灰恃佰挛は、筛洁の数恕に骄って、佰なった改客からのcDNA唆はゲノムライブラリ〖をプロ〖ブすることによってクロ〖ン步され评る。塑汤嘿今に倡绩されるヌクレオチド芹误の滦惟颁帕灰恃佰挛、毋えばサイレント仆脸恃佰を崔むそれらの恃佰挛第び仆脸恃佰がアミノ焕芹误恃构をもたらすそれらの恃佰挛は、塑汤嘿今に倡绩されるアミノ焕芹误の滦惟颁帕灰恃佰挛であるタンパク剂のように、塑券汤の认跋柒である。
≮0126≯
Ztnfr12ポリペプチドの拉剂を瘦积する、もう1つのスプライスされたmRNAから栏喇されるcDNAは、そのようなcDNA第びmRNAによりコ〖ドされるポリペプチドと票じように、塑券汤の认跋柒に蜀崔される。それらの芹误の滦惟颁帕灰恃佰挛第びスプライス恃佰挛は、碰度肠において梦られている筛洁の数恕に骄って、佰なった改客唆は寥骏からのcDNA唆はゲノムライブラリ〖をプロ〖ブすることによってクロ〖ン步され评る。
≮0127≯
塑券汤の攻ましい轮屯においては、帽违された乘焕尸灰は、塑汤嘿今に倡绩されるヌクレオチド芹误を崔んで喇る乘焕尸灰に滦して、钝教掘凤布でハイブリダイズするであろう。毋えば、そのような乘焕尸灰は、钝教掘凤布で、芹误戎规1のヌクレオチド芹误を崔んで喇る乘焕尸灰、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误から喇る乘焕尸灰、唆は芹误戎规1に滦して陵输弄なヌクレオチド芹误唆は芹误戎规1のヌクレオチド27≥578を崔んで喇る乘焕尸灰にハイブリダイズすることができる。办忍弄に、钝教掘凤は、年盗されたイオン动刨第びpHで、泼年の芹误のための钱拖突爬∈Tm∷よりも腆5☆你くあるよう联买される。Tmは、筛弄芹误の50◇が攻ましく努圭されたプロ〖ブに滦してハイブリダイズする补刨∈年盗されたイオン动刨第びpH布で∷である。
≮0128≯
1滦の乘焕尸灰、毋えばDNA-DNA, RNA-RNA第びDNA-RNAは、ヌクレオチド芹误がいくらかの镍刨の陵输拉を铜する眷圭、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド企脚ヘリックスにおけるミスマッチ宾答滦を钓推できるが、しかしハイブリッドの奥年拉はミスマッチの镍刨により逼读される。ミスマッチハイブリッドのTmは、1×1.5◇の宾答滦ミスマッチごとに1☆你布する。ハイブリダイゼ〖ション掘凤の钝教拉の恃构は、ハイブリッドに赂哼するであろうミスマッチの镍刨に滦する扩告を材墙にする。
≮0129≯
钝教拉の镍刨は、ハイブリダイゼ〖ション补刨が惧竞し、そしてハイブリダイゼ〖ション此咀闭のイオン动刨が你布するにつれて、惧竞する。钝教ハイブリダイゼ〖ション掘凤は、ハイブリッドの钱拖突爬∈Tm∷よりも腆5×25☆你い补刨、第び1MまでのNa+を铜するハイブリダイゼ〖ション此咀闭を蜀崔する。より你い补刨でのより光い补刨の钝教拉は、此咀拖闭における改」の1◇ホルムアミドについて腆1☆、ハイブリッドのTmを你めるホルムアミドの藕裁により茫喇され评る。办忍弄に、そのような钝教掘凤は、20×70☆の补刨、第び6∵SSC第び0×50◇のホルムアミドを崔むハイブリッド此咀闭を蜀崔する。
≮0130≯
光い镍刨の钝教拉は、40×70☆の补刨で第び4∵SSC第び0×50◇のホルムアミドを铜するハイブリダイゼ〖ション此咀闭により茫喇され评る。光い钝教掘凤は诺房弄には、42×70☆の补刨、第び1∵SSC第び0×50◇のホルムアミドを铜するハイブリダイゼ〖ション此咀闭を蜀崔する。佰なった镍刨の钝教闭が、筛弄芹误への呵络の泼佰弄冯圭を茫喇するために、ハイブリダイゼ〖ション、第び丽爵の粗、蝗脱され评る。诺房弄には、ハイブリダイゼ〖ションに鲁く丽爵は、ハイブリダイズされた剩圭挛からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプロ〖ブを近殿するために、惧竞する镍刨の钝教拉で乖われる。
≮0131≯
惧淡掘凤は、ガイドとして侯脱することを罢蹋し、そしてそれは泼年のポリペプチドハイブリッドとの蝗脱のためのそれらの掘凤を努圭するために、浇尸に碰度荚の墙蜗の认跋柒である。泼年の筛弄芹误についてのTmは、筛弄芹误の50◇が窗链に努圭されたプロ〖ブ芹误にハイブリダイズするであろう补刨∈年盗された掘凤布での∷である。Tmに逼读を第ぼすそれらの掘凤は、ポリヌクレオチドプロ〖ブのサイズ第び宾答滦崔铜唯、ハイブリダイゼ〖ション拖闭のイオン补刨、第びハイブリダイゼ〖ション拖闭における稍奥年步恨の赂哼を蜀崔する。
≮0132≯
Tmを纷换するための驴くの霹及は碰度肠において梦られており、そして硷」の墓さのDNA、RNA第びDNA≥RNAハイブリッド第びポリヌクレオチドプロ〖ブ芹误に滦して泼佰弄である∈毋えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988)〃 Ausubel など., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 第びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を徊救のこと∷。
≮0133≯
芹误尸老ソフトウェア、毋えばOLIGO6.0∈LSR; Long Lake, MN∷第びPrimer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 事びにインタ〖ネット惧のサイトが疥年の芹误を尸老し、そして蝗脱荚の年盗された答洁に答づいてTmを纷换するための缄檬を掐缄できる。そのようなプログラムはまた、年盗された掘凤布で疥年の芹弥を尸老し、そして努磊なプロ〖ブ芹误を票年することができる。诺房弄には、50笆惧の宾答滦の墓いポリヌクレオチド芹误のハイブリダイゼ〖ションは、纷换されたTmよりも腆20×25☆你い补刨で乖われる。50笆布の宾答滦の井さなプロ〖ブに簇しては、ハイブリダイゼ〖ションは诺房弄には、Tm唆はそれよりも5×10☆笆布で乖われる。これは、DNA≥DNA第びDNA≥RNAハイブリッドに簇して、呵络庐刨のハイブリダイゼ〖ションを材墙にする。
≮0134≯
ヌクレオチド芹误の墓さは、ハイブリッド妨喇の庐刨第び奥年拉に逼读を第ぼす。井さなプロ〖ブ芹误、すなわち50改笆布の宾答滦は、陵输弄芹误との士拐步にすばやく茫するが、しかし奥年したハイブリッドは妨喇されない。インキュベ〖ション箕粗∈およそ尸×箕∷が、ハイブリッド妨喇を茫喇するために蝗脱され评る。より墓いプロ〖ブ芹误はよりゆっくりと士拐步するが、しかし你い补刨でさえ、より奥年した剩圭挛を妨喇する。インキュベ〖ションは、办日唆はそれ笆惧の粗、渴乖せしめられる。办忍弄に、インキュベ〖ションは、纷换されたコット箕粗の3擒に霹しい袋粗、乖われ评る。コット箕粗、すなわちポリヌクレオチド芹误が浩柴圭するのにかかる箕粗は、碰度肠において梦られている数恕により、泼年の芹误について纷换され评る。
≮0135≯
ポリヌクレオチド芹误の宾答滦寥喇が、ハイブリッド剩圭挛の钱奥年拉をもたらし、それにより、ハイブリダイゼ〖ション补刨の联买第びハイブリダイゼ〖ション此咀闭のイオン动刨に逼读を第ぼす。A≥T滦は、宾步ナトリウムを崔む垮拖闭においてG≥C滦よりも你い奥年拉である。骄って、G≥C崔铜唯が光いほど、ハイブリッドはより奥年する。芹误柒のG第びC荒答の士霹な尸邵がまた、ハイブリッド奥年拉に赖に大涂する。
≮0136≯
さらに、宾答滦寥喇は、疥年の芹误のTmを恃えるために拎侯され评る。毋えば5≥メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより弥垂され评、そして5≥ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより弥垂され评、そして5≥ブロモデオキシウリジンはTmを光めるためにチミジンにより弥垂され、そして7≥デアズ≥2∏≥デオキシグアノシンは、Tmに滦する巴赂拉を你めるためにグアノシンにより弥垂され评る。
≮0137≯
ハイブリダイゼ〖ション此咀闭のイオン腔刨はまた、ハイブッリドの奥年拉に逼读お第ぼす。ハイブリダイゼ〖ション此咀闭は办忍弄にブロッキング恨、毋えばDenhardt拖闭∈Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.∷、恃拉されたサケ篮灰DNA、蚀讫∈BLOTTO∷、ヘパリン唆はSDS、第びNa+富、毋えばSSC∈1∵SSC¨0.15¨NのNaCl、15mMのクエン焕ナトリウム∷唆はSSPE∈1∵SSPE¨1.8MのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7∷を崔む。诺房弄には、ハイブリダイゼ〖ション此咀闭は、10mM×1MのNa+を崔む。
≮0138≯
稍奥年恨唆は恃拉恨、毋えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム宾、グアニジウムカチオン唆はチオシアネ〖トカチオンのハイブリダイゼ〖ション拖闭への藕裁が、ハイブリッドのTmを恃构するであろう。诺房弄には、ホルムアミドが、より守网で愁つ你い补刨でのインキュベ〖ションの悸卉を材墙にするために、50◇までの腔刨で蝗脱される。ホルムアミドはまた、RNAプロ〖ブを脱いる眷圭、润泼佰弄バッググラウンドを你めるためにも侯脱する。
≮0139≯
毋绩のように、恃佰挛Ztnfr12ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰が、芹误戎规1のヌクレオチド芹误∈唆はその陵输挛∷を铜する乘焕尸灰により、50◇ホルムアミド、5∵SSC、50mMのリン焕ナトリウム∈pH7.6∷、5∵Denhardt∏s 拖闭∈100∵Denhardt∏s 拖闭¨2◇∈w/v∷のFicoll 400, 2% (w/v)のポリビニルピロリドン第び2◇∈w/v∷のウシ缝蓝アルブミン∷、10◇の尾焕デキストラン第び20μg/mlの恃拉され、羊们されたサケ篮灰DNAを崔んで喇る拖闭において、42☆で办日ハイブリダイズされ评る。
≮0140≯
碰度荚は、それらのハイブリダイゼ〖ション掘凤の恃瓢拉を雇胃することができる。毋えば、ハイブリダイゼ〖ション寒圭湿は、ホルムアミドを崔まない拖闭において、光刨で、毋えば腆65☆でインキュベ〖トされ评る。さらに、徒洒寒圭されたハイブリダイゼ〖ション拖闭が掐缄でき∈毋えば、CLONTECH Laboratories, Inc. からのEXPRESSHYB Hybridization Solution∷·そしてハイブリダイゼ〖ションは澜陇度荚の棱汤今に骄って乖われ评る。
≮0141≯
ハイブリダイゼ〖ションに鲁いて、乘焕尸灰は、钝教掘凤布で、唆は光い钝教掘凤布で、ハイブリダイズされなかった乘焕尸灰を近殿するために丽爵され评る。诺房弄な钝教丽爵掘凤は、0.1◇ドデシル尾焕ナトリウム∈SDS∷を崔む0.5∵×2∵SSC拖闭による55×65◇での丽爵を蜀崔する。すなわち、恃佰挛Ztnfr12ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰は、钝教丽爵掘凤布で、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误∈唆はその输挛∷を铜する乘焕尸灰とハイブリダイズし、ここで涟淡丽爵钝教拉は、55×65☆での、0.1◇SDSを崔む0.5∵×2∵SSC拖闭、毋えば55☆での、0.1◇SDSを崔む0.5∵SSC拖闭、唆は65☆での0.1◇SDSを崔む2∵SSC拖闭に霹しい。碰度荚は、毋えば丽爵拖闭におけるSSCをSSPEにより弥垂することによって票霹の掘凤を推白に澜陇することができる。
≮0142≯
诺房弄な光い钝教丽爵掘凤は、50×65☆での0.1◇ドデシル尾焕ナトリウム∈SDS∷を崔む0.1∵×0.2∵SSCの拖闭による丽爵を蜀崔する。毋えば、恃佰挛Ztnfr12ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰は、光い钝教丽爵掘凤布で、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误∈唆はその输挛∷を铜する乘焕尸灰とハイブリダイズし、ここで涟淡丽爵钝教拉は、50×65☆での、0.1◇SDSを崔む0.1∵×0ˉ2∵SSC拖闭、毋えば50☆での、0.1◇SDSを崔む0.1∵SSC拖闭、唆は65☆での0.1◇SDSを崔む0.2∵SSC拖闭に霹しい。
≮0143≯
塑券汤はまた、芹误戎规2のポリペプチド唆はそれらのオルト挛に滦して悸剂弄に梧击する芹误票办拉を铜する帽违されたZtnfr12ポリペプチドも捏丁する。脱胳∪悸剂弄に梧击する芹误票办拉∩とは、芹误戎规2で绩される芹误唆はそれらのオルト挛に滦して警なくとも70◇、警なくとも80◇、警なくとも95◇笆惧の芹误票办拉を铜するポリペプチドを绩すために塑汤嘿今において蝗脱される。
≮0144≯
塑券汤はまた、2硷の肌の答洁を脱いて票年され评るZtnfr12恃佰挛乘焕尸灰を措茶する¨芹误戎规2のアミノ焕芹误とコ〖ドされたポリペプチドとの粗の梧击拉の疯年、第びハイブリダイゼ〖ションアッセイ。そのようなZtnfr12恃佰挛は、∈1∷55×65☆での0.1◇SDSを崔む0.5∵×2∵SSC拖闭に霹しい钝教丽爵掘凤布で、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误∈唆はその输挛∷を铜する乘焕尸灰とハイブリダイズし、そして∈2∷芹误戎规2のアミノ焕芹误に滦して警なくとも70◇,警なくとも80◇,警なくとも90◇,警なくとも95◇唆は95◇笆惧の芹误票办拉を铜するポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰を蜀崔する。
≮0145≯
戮数では、Ztnfr12恃佰挛は、∈1∷50×65☆での0.1◇SDSを崔む0.1∵×0.2∵SSC拖闭に霹しい、光い钝教丽爵掘凤布で、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误∈唆はその输挛∷を铜する乘焕尸灰とハイブリダイズし、そして∈2∷芹误戎规2のアミノ焕芹误に滦して警なくとも70◇,警なくとも80◇,警なくとも90◇,警なくとも95◇唆は95◇笆惧の芹误票办拉を铜するポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰として泼魔づけられ评る。
≮0146≯
◇芹误票办拉は、骄丸の数恕により疯年される。毋えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603≥616, 1986第びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915≥10919, 1992を徊救のこと。缄没に咐第するば、2硷のアミノ焕芹误が、10のギャップ倡幌ペナルティ〖、1のギャップ橙磨ペナルティ〖、第び山4∈アミノ焕は筛洁の1矢机コ〖ドにより绩される∷に绩されるようなHenikoff and Henikoff ∈涟淡∷の∪BLOSUM62∩删爬マトリックスを脱いて、その腊圭删爬を呵努步するために腊圭される。肌に、◇票办拉が肌のようにして纷换される¨∈∥票办の努圭するものの圭纷眶∠】[より墓い芹误の墓さ≤ 2硷の芹误を腊圭するためにそのより墓い芹误面に瞥掐されるギャップの眶]∷∈100∷。
≮0147≯
≮山4≯


≮0148≯
碰度荚は、2硷のアミノ焕芹误を腊误するために驴くの澄惟されたアルゴリズムが赂哼することを妄豺している。Pearson and Lipmanの∪FASTA∩梧击拉拇汉アルゴリズムは、塑汤嘿今に倡绩される1つのアミノ焕芹误第び夸年惧のZtnfr12恃佰挛のアミノ焕芹误により鼎铜される票办拉のレベルを活赋するための努磊なタンパク剂腊误数恕である。涟淡FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat∏l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 第びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により淡很される。缄没には、FASTAがまず、啼玛の芹误∈毋えば、芹误戎规2∷第び瘦赂拉アミノ焕弥垂、赁掐唆は风己を雇胃しないで、呵光泰刨の票办拉∈ktup恃眶が1である眷圭∷唆は滦の票办拉∈ktup♂2である眷圭∷のいずれかを铜する活赋芹误により鼎铜される挝拌を票年することによって芹误を泼魔づける。
≮0149≯
肌に、呵光泰刨の票办拉を铜する10の挝拌が、アミノ焕弥垂マトリックスを脱いて、すべての滦圭されたアミノ焕の梧击拉を孺秤することによって浩删擦され、そして涟淡挝拌の琐眉が、呵光の删爬に大涂するそれらの荒答のみを崔むよう∪腊えられる∩。∪カットオフ∩猛∈芹误の墓さ第びktup猛に答づいて徒年された及により纷换される∷よりも光い删爬を铜するいくつかの挝拌が赂哼する眷圭、その腊えられた介袋挝拌が、その挝拌がギャップとのおおよその办误芹误を妨喇するために冯圭され评るかどうかを疯年するために活赋される。
≮0150≯
呵姜弄に、2硷のアミノ焕芹误の呵光删爬挝拌が、アミノ焕赁掐第び风己を材墙にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム∈Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974∷の恃恕を脱いて腊误される。FASTA 尸老のための攻ましいパラメ〖タ〖は肌のものである¨ktup♂1、ギャップ倡幌ペナルティ〖♂10、ギャップ橙磨ペナルティ〖♂1第び弥垂マトリックス♂BLOSUM62。それらのパラメ〖タ〖は、Appendix 2 of Pearson, 1990 (涟淡)に棱汤されるように、删爬マトリックスを拇泪することによってFASTAプログラム面に瞥掐され评る。
≮0151≯
FASTAはまた、惧淡に倡绩されるような充圭を脱いて、乘焕尸灰の芹误票办拉を疯年するためにも蝗脱され评る。ヌクレオチド芹误孺秤のためには、ktup猛は、惧淡に肋年される戮のパラメ〖タ〖を燃なって、1×6、攻ましくは3×6、呵も攻ましくは3であり评る。
≮0152≯
塑券汤は、塑汤嘿今に倡绩されるアミノ焕芹误に孺秤して、1唆は剩眶の瘦赂拉アミノ焕恃构を铜するポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰を蜀崔する。毋えば、芹误戎规2の1唆は剩眶のアミノ焕弥垂を崔む恃佰挛が评られ、ここでアルキルアミノ焕がZtnfr12アミノ焕芹误におけるアルキルアミノ焕に洛わって弥垂され、帅贯虏アミノ焕がZtnfr12アミノ焕における帅贯虏アミノ焕に洛わって弥垂され、尾搏崔铜アミノ焕がZtnfr12アミノ焕芹误における尾搏崔铜アミノ焕に洛わって弥垂され、ヒドロキシ崔铜アミノ焕Ztnfr12アミノ焕芹误におけるヒドロキシ崔铜アミノ焕に洛わって弥垂され、焕拉アミノ焕がZtnfr12アミノ焕芹误における焕拉アミノ焕に洛わって弥垂され、宾答拉アミノ焕がZtnfr12アミノ焕芹误における宾答拉アミノ焕に洛わって弥垂され、唆は企宾答拉モノカルボン焕アミノ焕Ztnfr12アミノ焕芹误における企宾答拉モノカルボン焕アミノ焕に洛わって弥垂される。
≮0153≯
奶撅のアミノ焕の面で、∪瘦赂拉アミノ焕弥垂∩は、肌のグル〖プの改」柒のアミノ焕粗の弥垂により绩される¨∈1∷グリシン、アラニン、バリン、ロイシン第びイソロイシン、∈2∷フェニルアラニン、チロシン第びトリプトファン、∈3∷セリン第びトレオニン、∈4∷アスパラギン焕第びグルタミン焕、∈5∷グルタミン第びアスパラギン、第び∈6∷リシン、アルギニン第びヒスチジン。
≮0154≯
BLOSUM62山は、簇息するタンパク剂の500笆惧のグル〖プの光く瘦赂された挝拌を山す、タンパク剂芹误セグメントの腆2,000の渡婶の剩眶腊误に统丸するアミノ焕弥垂マトリックスである∥Henikoff and Henikoff, Proc. Nat∏l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ∠。骄って、BLOSUM62弥垂裳刨は、塑券汤のアミノ焕芹误面に瞥掐され评る瘦赂拉アミノ焕弥垂を年盗するために蝗脱され评る。帽に步池弄拉剂に答づいてのアミノ焕弥垂を措茶することが材墙であるが∈惧淡で侠じられたように∷、脱胳∪瘦赂拉アミノ焕弥垂∩とは、≥1よりも络きなBLOSUM62猛により山される弥垂を咐第する。毋えば、アミノ焕弥垂は、その弥垂が0·1·2唆は3のBLOSUM62猛により泼魔づけられる眷圭、瘦赂拉である。このシステムによれば、攻ましい瘦赂拉アミノ焕弥垂は、警なくとも1∈毋えば、1·2唆は3∷のBLOSUM62猛により泼魔づけられ、ところがより攻ましくは瘦赂拉弥垂は、警なくとも2∈毋えば、2唆は3∷のBLOSUM62猛により泼魔づけられる。
≮0155≯
办年の瘦赂拉アミノ焕弥垂が、ヒト第びネズミZtnfr12アミノ焕芹误を办误腊误することによって票年され评る。毋えば、办误腊误は、芹误戎规2のヒトZtnfr12アミノ焕芹误における肌のアミノ焕弥垂、すなわちAla15のVal15への、Arg39のHis39への、第びAla71のLeu71への弥垂を绩す。そのような办误腊误は、ヒトZtnfr12アミノ焕芹误の戮の瘦赂拉アミノ焕弥垂、唆はネズミZtnfr12アミノ焕芹误の瘦赂拉アミノ焕弥垂を票年する。
≮0156≯
Ztnfr12の泼年の恃佰挛が、その滦炳するアミノ焕芹误∈すなわち、芹误戎规2∷に滦して、警なくとも70◇、警なくとも80◇、警なくとも90◇、警なくとも95◇唆は95◇笆惧の芹误票办拉を铜することによって泼魔づけられ、ここでアミノ焕芹误の恃瓢は、1唆は剩眶のアミノ焕弥垂による。
≮0157≯
Ztnfr12颁帕灰における瘦赂拉アミノ焕恃步が、芹误戎规1のいずれか1つに误刁されるヌクレオチドに洛わってヌクレオチドを弥垂することによって瞥掐され评る。そのような∪瘦赂拉アミノ焕∩恃佰挛は、毋えばオリゴヌクレオチド回哭された仆脸恃佰投券、リンカ〖瘤汉仆脸恃佰投券、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いての仆脸恃佰投券第び票屯の数恕により评られる∈Ausubel∈1995∷pages8-10×8-22; 第びMcPhrson∈ed.∷, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) を徊救のこと∷。恃佰挛Ztnfr12ポリペプチドが、钩≥Ztnfr12钩挛を泼佰弄に冯圭する墙蜗により票年され评る。
≮0158≯
塑券汤のタンパク剂はまた、欧脸に赂哼しないアミノ焕荒答を崔んで喇る。欧脸に赂哼しないアミノ焕は、トランス≥3≥メチルプロリン、2,4≥メタプロリン、シス≥4≥ヒドロキシプロリン、トランス≥4≥ヒドロキシプロリン、N≥メチルグリシン、アロ≥トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン焕、チアゾリジンカルボン焕、デヒドロプロリン、3≥第び4≥メチルプロリン、3,3≥ジメチルプロリン、tert≥ロイシン、ノルバリン、2≥アザフェニルアラニン、3≥アザフェニルアラニン、4≥アザフェニルアラニン、第び4≥フルオロフェニルアラニンを蜀崔する。
≮0159≯
欧脸に赂哼しないアミノ焕荒答をタンパク剂面に瞥掐するためのいくつかの数恕が碰度肠において梦られている。毋えばナンセンス仆脸恃佰が步池弄にアミノアシル步されたサプレッサ〖tRNAを脱いて娃扩されるインビトロシステムが蝗脱され评る。アミノ焕を圭喇し、そしてtRNAをアミノアシル步するための数恕は、碰度荚において梦られている。ナンセンス仆脸恃佰を崔むプラスミドの啪继第び溯条は、E.コリS30藐叫湿第び辉任の冠燎第び戮の活挑の崔んで喇る嘿甩フリ〖システムにおいて悸卉される。タンパク剂は、クロマトグラフィ〖により篮澜される。毋えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806≥09, 1993; 第びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145≥49, 1993を徊救のこと。
≮0160≯
妈2の数恕においては、溯条は、仆脸恃佰投券されたmRNA第び步池弄にアミノアミル步されたサプレッサ≥tRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル婉熟嘿甩において乖われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991≥98, 1996 )。 妈3の数恕においては、E.コリ嘿甩が、弥垂される徒年である欧脸のアミノ焕∈毋えば、フェニルアラニン∷の稍哼布で第び疥司する欧脸に赂哼しないアミノ焕∈毋えば、2≥アザフェニルアラニン、3≥アザフェニルアラニン、4≥アザフェニルアラニン唆は4≥フルオロフェニルアラニン∷の赂哼布で禽蛙される。
≮0161≯
欧脸に赂哼しないアミノ焕は、その欧脸の陵滦湿の洛わりにタンパク剂面に瞥掐される。Koide など., Biochem. 33: 7470≥46, 1994を徊救のこと。欧脸に赂哼するアミノ焕荒答は、インビトロ步池弄に饯峻により欧脸に赂哼しない硷に啪垂され评る。步池弄饯峻は、弥垂の认跋をさらに橙磨するために泼年婶疤の仆脸恃佰投券と寥み圭わされ评る∈Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395≥403, 1993)。
≮0162≯
嘎年された眶の润瘦赂拉アミノ焕、颁帕灰コ〖ドによりコ〖ドされないアミノ焕、欧脸に赂哼しないアミノ焕、第び稍极脸なアミノ焕が、Ztnfr12アミノ焕により弥垂され评る。
≮0163≯
塑券汤のポリペプチドにおける涩寇アミノ焕は、碰度肠において梦られている数恕、毋えば泼年婶疤の仆脸恃佰投券唆はアラニン≥瘤汉仆脸恃佰投券により票年され评る∈Cunningham and Wells, Science 244: 1081≥1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498≥502, 1991∷, Coombs and Corey, ∪Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering∩ ,in Proteins: Analysis and Design, Angeletti(ed.) Ppages 259-311(Academic Press, Inc. 1998))。稿荚の祷恕においては、帽办のアラニン仆脸恃佰が尸灰面のあらゆる荒答で瞥掐され、そして评られる恃佰挛尸灰が、涟淡尸灰の宠拉に滦して疯年弄であるアミノ焕荒答を票年するために、布淡に倡绩されるようして、栏湿池弄宠拉について活赋される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699≥5708, 1996を徊救のこと。
≮0164≯
芹误尸老はZtnfr12减推挛冯圭婶疤を票年するために蝗脱され评るが、Ztnfr12减推挛冯圭ドメインの疤弥はまた、夸年惧の儡卡婶疤アミノ焕の仆脸恃佰と鼎に、乘姬丹鼎棠、冯窘池、排灰搀擂唆は各科下拉ラベリングのような祷恕により疯年されるように、菇陇挛の湿妄弄尸老によっても疯年され评る。毋えば、de Ves など., Science 255: 306 (1992), Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), 第びWlodaver など., FEBS Lett. 309:59 (1992) を徊救のこと。
≮0165≯
剩眶アミノ焕弥垂は、仆脸恃佰投券第びスクリ〖ニングの贷梦数恕、毋えばReidhaar≥Olson and Sauer ∈science 241: 53≥57, 1988∷唆はBowie and Sauer∈ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152≥2156,1989 ∷により倡绩される数恕を脱いて乖われ、そして活赋される。缄没に咐第すれば、それらの螟荚は、ポリペプチドにおける剩眶の疤弥を票箕ランダム步し、怠墙弄ポリペプチドをスクリ〖ンし、そして肌に改」の疤弥での材墙な弥垂の认跋を疯年するために、仆脸恃佰投券されたポリペプチドを芹误疯年するための数恕を倡绩する。
≮0166≯
蝗脱され评る戮の数恕は、ファ〖ジ山绩∈毋えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832≥10837,1991; Ladner など., アメリカ泼钓妈5,223,409规; Huse, WIPO给倡WO 92】06204规∷、第び挝拌≥回哭された仆脸恃佰投券∈Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ∷を蜀崔する。さらに、ビオチン唆はFITCによりラベルされたZtnfr12は、糠惮Ztnfr12リガンドの券附クロ〖ニングのために蝗脱され评る。
≮0167≯
倡绩されるZtnfr12ヌクレオチド第びポリペプチド芹误の恃佰挛は、Stemmer, Nature 370 : 389≥91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747≥51, 1994第びWIPO给倡WI97】20078により倡绩されるように、DNA シャフリングを奶して栏喇され评る。缄没に咐第すれば、恃佰挛DNA尸灰が、ランダムに瞥掐された爬仆脸恃佰をもたらす、科DNAのランダム们室步、鲁く、PCRを脱いてのアセンブリ〖によるインビトロ陵票寥垂えにより栏喇される。この祷恕は、涟淡供镍面に纳裁の恃瓢拉を瞥掐するために、科DNAのファミリ〖、毋えば佰なった硷からの滦惟颁帕灰恃佰挛唆はDNAを脱いて猖紊され评る。疥司する宠拉の联买唆はスクリ〖ニング、仆脸恃佰投券第びアッセイの鲁くさらなる陵高侯脱が、铜巢な恃步に滦して票箕に联买しながら、疥司する仆脸恃佰について联买することによって、芹误の缔庐な∪渴步∩を捏丁する。
≮0168≯
塑汤嘿今に倡绩されるような仆脸恃佰投券数恕は、缴肩嘿甩におけるクロ〖ン步された仆脸恃佰投券されたポリペプチドの宠拉を浮叫するために光借妄翁の极瓢步されたスクリ〖ニング数恕と寥み圭わされ评る。栏湿池弄に宠拉のポリペプチド唆は钩≥Ztnfr12钩挛と冯圭するポリペプチドをコ〖ドする仆脸恃佰投券されたDNA尸灰が、缴肩嘿甩から搀箭され、そしてすぐに、夺洛弄刘弥を脱いて芹误され评る。それらの数恕は、督蹋あるポリペプチドにおける改」のアミノ焕荒答の脚妥拉の缔庐な疯年を材墙にし、そして踏梦の菇陇のポリペプチドに努脱され评る。
≮0169≯
塑券汤はまた、Ztnfr12ポリペプチドの∪怠墙弄フラグメント∩第びそのような怠墙弄フラグメントをコ〖ドする尸灰を蜀崔する。乘焕尸灰の奶撅の风己尸老は、Ztnfr12ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰の怠墙弄フラグメントを评るために乖われ评る。毋绩されるように、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误を铜するDNA尸灰は、办息の风己を评るためにBal3 Tヌクレア〖ゼにより久步され评る。
≮0170≯
肌に、フラグメントが赖しい粕み艰り先を腊圭して券附ベクタ〖面に赁掐され、そして券附されたポリペプチドが帽违され、そして嘿甩≥嘿甩陵高侯脱について、唆はZtnfr12钩挛を冯圭する墙蜗について活赋される。エキソヌクレア〖ゼ久步のための1つの数恕は、风己を瞥掐するためにオリゴヌクレオチド≥回哭された仆脸恃佰投券を蝗脱し、唆は疥司するフラグメントの栏喇を泼年するために匿贿コドンを蝗脱することである。戮数では、Ztnfr12颁帕灰の泼年のフラグメントは、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いて圭喇され评る。怠墙弄フラグメントの毋は、Ztnfr12の嘿甩嘲ドメイン∈すなわち、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79∷である。
≮0171≯
この办忍弄アプロ〖チは、インタ〖フェロンのいずれかの唆は尉琐眉での磊们に答づいての甫垫が、Horisberger and Di Marco, pharmac. Ther. 66: 507 (1995) により妥腆されることにより毋绩される。さらに、タンパク剂の怠墙弄尸老のための筛洁祷恕は、毋えばTreulterなど., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content など., ∪Expression and preliminary deletion analysisi of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon∩, in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, ∪The EGF Enzyme∩, in Cortrol of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton など., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Counailleau など., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga など., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi など., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); 第びMeiselなど., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)により淡很される。
≮0172≯
塑券汤はまた、塑汤嘿今に倡绩されるアミノ芹误に孺秤して、アミノ芹误恃步を铜するZtnfr12颁帕灰の怠墙弄フラグメントも措茶する。恃佰挛Ztnfr12颁帕灰は、惧淡のように、倡绩されるヌクレオチド第びアミノ焕芹误との票办拉のレベルを疯年することにより、菇陇挛に答づいて票年され评る。菇陇挛に答づいて恃佰挛颁帕灰を票年するもう1つのアプロ〖チは、材墙拉ある恃佰挛Ztnfr12颁帕灰をコ〖ドする乘焕尸灰が、惧淡のように、芹误戎规1のヌクレオチド芹误を铜する乘焕尸灰にハイブリダイズすることができるかどうかを疯年することである。
≮0173≯
塑券汤はまた、塑汤嘿今に淡很されるZtnfr12ポリペプチドのエピト〖プ≥么积の婶尸を崔んで喇るポリペプチドフラグメント唆はペプチドも捏丁する。そのようなフラグメント唆はペプチドは、窗链なタンパク剂が倘敝付として蝗脱される眷圭、钩挛炳批を投券するタンパク剂の办婶である∪倘敝付拉エピト〖プを崔んで喇る。倘敝付拉エピト〖プ≥么积のペプチドは、筛洁数恕を脱いて票年され评る。∈毋えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を徊救のこと∷。
≮0174≯
滦救弄に、ポリペプチドフラグメント唆はペプチドは、钩挛が泼佰弄に冯圭することができるタンパク剂尸灰の挝拌である∪钩付拉エピト〖プ∩を崔んで喇る。办年のエピト〖プは、俐觉唆は息鲁した认跋のアミノ焕から喇り、そしてそのようなエピト〖プの钩付拉は、恃拉恨により撬蝉されない。タンパク剂のエピト〖プを滔曙する孺秤弄没い圭喇ペプチドがタンパク剂に滦する钩挛の栏喇を簧枫するために蝗脱され评ることは、碰度肠において梦られている∈毋えば、Sutcliffeなど., Science 219: 660, 1983を徊救のこと∷。骄って、塑券汤の钩付拉エピト〖プ≥么积のペプチド第びポリペプチドは、塑汤嘿今に淡很されるポリペプチドと冯圭する钩挛を栏ぜしめるために铜脱である。
≮0175≯
钩付拉エピト〖プ≥么积のペプチド第びポリペプチドは攻ましくは塑汤嘿今に倡绩されるアミノ焕芹误の警なくとも4×10改のアミノ焕、警なくとも10×15改のアミノ焕、唆は腆15×腆30改のアミノ焕を崔む。そのようなエピト〖プ≥么积のペプチド第びポリペプチドは、塑汤嘿今に淡很されるように、Ztnfr12ポリペプチドのフラグメント步唆は步池弄ペプチド圭喇により栏喇され评る。さらに、エピト〖プは、ランダムペプチドライブラリ〖のファ〖ジ山绩により联买され评る∈毋えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 第びCortese など., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を徊救のこと∷。
≮0176≯
エピト〖プを崔んで喇る井さなペプチドからエピト〖プを票年し、そして钩挛を栏喇するための筛洁の数恕は、毋えばMole, ∪Epitope Mapping,∩ in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana Press, Inc., 1992), Price, ∪Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,∩ in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-84 (Cambridge University Press 1995), 第びColigan など. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997)により淡很される。
≮0177≯
惧淡の蝗脱の戮に、塑券汤のポリヌクレオチド第びポリペプチドは、颁帕灰池第び尸灰栏湿池、タンパク剂步池第び钩挛栏喇第び尸老に簇息する册镍のための悸赋技脱悸卉キットにおける兜伴缄檬として铜脱である。そのユニ〖クなポリヌクレオチド第びポリペプチド芹误のために、Ztnfr12の尸灰は活赋誊弄のための筛洁として、唆は∪踏梦のもの∩として蝗脱され评る。
≮0178≯
毋えば、Ztnfr12ポリヌクレオチドは、Ztnfr12が券附されるべき颁帕灰である、突圭菇喇挛を蜀崔する、嘿遁、ウィルス唆は赢讫梧券附のための券附菇喇挛をいかにして拇澜するか、栏盘に兜鉴するための〃ポリヌクレオチドの扩嘎エンドヌクレア〖ゼ尸豺婶疤の疯年のための〃寥骏におけるZtnfr12ポリヌクレオチドのmRNA第びDNA渡哼步の疯年のための∈すなわち、ノザン第びサザンブロット、第びポリメラ〖ゼ嚎瓤炳による∷〃第び乘焕ハイブリダイゼ〖ションにより簇息するポリヌクレオチド第びポリペプチドの票年のための锦恨として蝗脱され评る。毋绩として、池栏は、芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误から喇る乘焕尸灰のPstI久步が腆174宾答滦第び378宾答滦の2硷のフラグメントを捏丁し、そしてHinfI久步が腆182宾答滦、226宾答滦、第び144宾答滦のフラグメントを栏喇することを斧叫すであろう。
≮0179≯
Ztnfr12ポリペプチドは、钩挛の拇澜の兜鉴のための〃ウェスタ〖ンブロットによるタンパク剂の票年のための〃タンパク剂篮澜のための〃券附される圭纷タンパク剂に滦する孺唯としての券附されるZtnfr12ポリペプチドの脚翁を疯年するための〃ペプチド尸豺婶疤の票年のための〃アミノ第びカルボキシル琐眉筛急のカップリングのための〃アミノ焕芹误尸老のための〃第び欧脸第び筛急されたタンパク剂の尉荚の栏湿池弄宠拉∈すなわち、プロテア〖ゼ了巢∷のインビトロ第びインビボでのモニタ〖のための锦恨として蝗脱され评る。毋えば、池栏は、エンドペプチダ〖ゼLys Cによるグリコシル步されていないZtnfr12の久步が4370, 7691, 883, 4758第び729のおおよその尸灰翁を铜する5硷のフラグメントを栏喇し、そしてBNPS唆はNCS/ウレアによるグリコシル步されていないZtnfr12の久步が10279, 4740第び3877のおおよその尸灰翁を铜するフラグメントを栏喇することを斧叫すであろう。
≮0180≯
Ztnfr12ポリペプチドはまた、尸老较锡、毋えば、泼に4硷のαヘリックスのコンホメ〖ションを疯年するために剂翁尸各池、边企咖拉を、付灰弄に拒嘿に惟挛菇陇を疯年するためにX≥俐冯窘池を、拖闭でのタンパク剂の菇陇を山すために乘姬丹鼎棠尸各池を兜鉴するためにも蝗脱され评る。毋えば、Ztnfr12を崔むキットは、尸老する池栏に涂えられ评る。アミノ焕芹误は兜鉴によっては梦られているので、すなわちタンパク剂は、池栏の较锡を疯年するか、唆は池栏の较锡を倡券するための活赋として池栏に涂えられるので、兜鉴は、池栏がポリペプチドを赖しく尸老したか唆はしなかったかを梦るであろう。あらゆるポリペプチドはユニ〖クであるので、Ztnfr12の兜伴池弄网脱拉はそれ极挛ユニ〖クであろう。
≮0181≯
Ztnfr12に滦して泼佰弄に冯圭する钩挛は、Ztnfr12を篮澜するために科下澜クロマトグラフィ〖カラムをいかにして拇澜するかを、池栏に兜鉴するための兜鉴锦恨として、钩挛をコ〖ドするポリヌクレオチドをクロ〖ニングし、そして芹误疯年するための兜鉴锦恨として、第び骄って、ヒト步钩挛をいかにして措茶するか、池栏を兜鉴するための悸浆草誊として蝗脱され评る。Ztnfr12颁帕灰、ポリペプチド唆は钩挛は、活挑柴家によりパッケ〖ジングされ、そして池栏が尸灰栏湿池の较锡を评るために兜伴怠簇に辉任されている。改」の颁帕灰第びタンパク剂はユニ〖クであるので、改」の颁帕灰第びタンパク剂は悸赋悸浆草誊における池栏のためのユニ〖クな末里第び池浆沸赋を料陇する。Ztnfr12颁帕灰ポリペプチド唆は、钩挛を崔むそのような兜伴脱キットは、塑券汤の认跋柒にあると蛔われる。
≮0182≯
恃佰挛第び突圭タンパク剂を蜀崔するいずれかのZtnfr12ポリペプチドに簇しては、碰度荚は、惧淡山1第び2に绩される攫鼠を脱いて、その恃佰挛をコ〖ドする浇尸な教脚ポリヌクレオチド芹误を推白に栏喇することができる。さらに、碰度荚は、塑汤嘿今に淡很されるヌクレオチド第びアミノ焕芹误に答づいて、硷」のZtnfr12恃佰挛に筛洁のソフトウェアを蝗脱することができる。骄って、塑券汤は、肌の芹误、すなわち芹误戎规1、2第び3の警なくとも1つの芹误を捏丁するデ〖タ菇陇によりコ〖ドされるコンピュ〖タ〖に粕み艰り材墙寝挛を蜀崔する。
≮0183≯
努磊な妨のコンピュ〖タ〖粕み艰り材墙寝挛は、姬丹寝挛第び各池弄粕み艰り材墙な寝挛蜀崔する。姬丹寝挛の毋は、ハ〖ド唆は盖年されたドライブ、ランダムアクセス淡脖∈RAM∷チップ、フロッピ〖∈判峡睛筛∷ディスク、デジタルリニア〖テ〖プ∈DLT∷、ディスクカ〖シ第びZIPディスクを蜀崔する。各池弄粕み艰り材墙な寝挛は、コンパクトディスク∈毋えば、CD≥粕み艰りのみ淡脖∈ROM∷、CD≥浩今き哈みできる∈RW∷第びCD≥浩淡峡できる∷、第びデジタル材啪拉/ビデオディスク∈DVD∷∈毋えば、DVD≥ROM, DVD≥RAM第びDVD≤RW∷により毋绩される。
≮0184≯
5ˉZtnfr12ポリペプチドの栏喇
浇尸な墓さのポリペプチド、怠墙弄フラグメント第び突圭タンパク剂を蜀崔する塑券汤のポリペプチドは、骄丸の祷恕に骄って、寥垂え缴肩嘿甩において栏喇され评る。Ztnfr12颁帕灰を券附するためには、ポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰が、券附ペプチドにおいて啪继券附を扩告し、そして肌に、缴肩嘿甩面に瞥掐される拇泪芹误に侯脱材墙に息冯されるべきである。啪继拇泪芹误、毋えばプロモ〖タ〖第びエンハンサ〖の戮に、券附ベクタ〖は、溯条拇泪芹误、第び券附ベクタ〖を么积する嘿甩の联买のために努磊なマ〖カ〖颁帕灰を蜀崔することができる。
≮0185≯
靠乘嘿甩において嘲丸拉タンパク剂の栏喇のために努磊である券附ベクタ〖は、诺房弄には、∈1∷嘿甩缴肩における券附ベクタ〖の笼浚第び联买を捏丁するための嘿遁剩澜弹爬第び钩栏湿剂卵拉マ〖カ〖をコ〖ドする靠乘DNA妥燎〃∈2∷啪继の倡幌を扩告する靠乘DNA妥燎、毋えばプロモ〖タ〖〃第び∈3∷啪继挛のプロセッシングを扩告するDNA妥燎、毋えば啪继姜冯/ポリアデニル步芹误を崔む。惧淡で侠じられたように、券附ベクタ〖はまた、佰硷ポリペプチドを、缴肩嘿甩の尸如沸烯面に数羹づける尸如芹误コ〖ドするヌクレオチド芹误を蜀崔する。毋えば、Ztnfr12券附ベクタ〖は、Ztnfr12颁帕灰、第びいずれかの尸如された颁帕灰に统丸する尸如芹误を崔むことができる。
≮0186≯
Ztnfr12の券附は、Ztnfr12颁帕灰の润コ〖ド婶尸を蜀崔するか唆は蜀崔しない乘焕尸灰を脱いて茫喇され评る。しかしながら、办年の寥垂え缴肩嘿甩からのより光い栏喇跟唯が、警なくとも1つのZtnfr12イントロン芹误が券附ベクタ〖に蜀崔される眷圭に评られる。
≮0187≯
塑券汤のZtnfr12タンパク剂は、赢讫梧嘿甩において券附され评る。努磊な赢讫梧缴肩嘿甩の毋は、アフリカミドリザル空嘿甩∈Vero; ATCC CRL1587∷、ヒト骢空嘿甩∈293≥HEK; ATCC CRL1573∷、灰丁のハムスタ〖空嘿甩∈BHK≥21, BHK≥570〃ATCC CRL8544, ATCC CRL10314∷、イヌ空嘿甩∈MDCK〃ATCC CCL34∷、チャイニ〖ズハムスタ〖婉零嘿甩∈CHO≥K1; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)]、ラット布库挛嘿甩∈CH1〃ATCC CCL82∷、HeLa S3嘿甩∈ATCC CCL2.2∷、ラット次粹嘿甩∈H≥4≥II≥E〃ATCC CRL1548∷、SV40≥妨剂啪垂されたモンキ〖空嘿甩∈COS≥1〃ATCC CRL1650∷第びネズミ骢嘿甩∈NIH≥3T3〃ATCC CRL1658∷を蜀崔する。
≮0188≯
赢讫梧缴肩に簇しては、啪继第び溯条シグナルは、ウィルス富、毋えばアデノウィルス、ウシ讫片拣ウィルス、サルウィルス唆は票屯のものに统丸することができ、ここで拇泪するシグナルは、光レベルの券附を铜する泼年の颁帕灰に簇息している。努磊な啪继第び溯条拇泪芹误はまた、赢讫梧颁帕灰、毋えばアクチン、コラ〖ゲン、ミコシン第びメタロチオネイン颁帕灰から评られる。
≮0189≯
啪继拇泪芹误は、RNA圭喇の倡幌を数羹づけるために浇尸なプロモ〖タ〖挝拌を崔む。努磊な靠乘プロモ〖タ〖は、マウスメタロチオネインI颁帕灰のプロモ〖タ〖∈Hamerなど., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)∷、ヘルペスウィルスのTKプロモ〖タ〖∈Mcknight, Cell 31 : 355 (1982)∷、SV40介袋プロモ〖タ〖∈Benoistなど., Nature 290: 304 (1981)∷、Rous迄拣ウィルスプロモ〖タ〖∈Gormanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)∷、サイトメガロウィルスプロモ〖タ〖∈Foeckingなど., Gene 45: 101 (1980)∷第びマウス讫拣徵ウィルスプロモ〖タ〖∈办忍弄には、Etcheverry, ∪Expression of Engineered Protein in Mammalian Cell Culture∩, in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など., (eds.), p. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を徊救のこと∷を蜀崔する。
≮0190≯
戮数では、付乘プロモ〖タ〖、毋えばバクテリオファ〖ジT3 RNAポリメラ〖ゼプロモ〖タ〖は、その付乘プロモ〖タ〖が靠乘プロモ〖タ〖により拇泪される眷圭、赢讫梧嘿甩におけるZtnfr12颁帕灰券附を扩告するために蝗脱され评る∈Zhouなど., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), 第びKaukamanなど., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991) を徊救のこと∷。
≮0191≯
券附ベクタ〖は、硷」の筛洁の祷恕、毋えばリン焕カルシウムトランスフェクション、リポソ〖ム≥拆哼拉トランスフェクション、マイクロプロジェクト≥拆哼拉丁惦、エレクトロポレ〖ション第び票屯のものを脱いて、缴肩嘿甩面に瞥掐され评る。攻ましくは、トランスフェクトされた嘿甩が联买され、そして笼浚され、缴肩嘿甩ゲノムに奥年して寥み哈まれる券附ベクタ〖を崔んで喇る寥垂え缴肩嘿甩が丁惦される。靠乘嘿甩面にベクタ〖を瞥掐するための祷恕、第び庭拉联买マ〖カ〖を脱いてのそのような奥年した妨剂啪垂挛を联买するための祷恕は、毋えばAusubel (1995) 第びMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991) により淡很される。
≮0192≯
毋えば、1つの努磊な联买マ〖カ〖は、钩栏湿剂ネオマイシンに滦する卵拉を烧涂する颁帕灰である。この眷圭、联买は、ネオマイシン房挑湿、毋えばG≥418唆は票屯のもの赂哼布で悸卉される。∪笼升∩として咐第される数恕である联买システムは、督蹋ある颁帕灰の券附レベルを光めるためにも蝗脱される。笼升は、你レベルの联买恨の赂哼布でトランスフェクタントを禽蛙し、そして肌に、瞥掐された颁帕灰の栏喇湿を光レベルで栏喇する嘿甩を联买するために联买恨の翁を光めることによって悸卉される。
≮0193≯
攻ましい笼升材墙联买マ〖カ〖は、メトトレキセ〖トに滦する卵拉を烧涂するジヒドロ驼焕レダクタ〖ゼである。戮の卵挑湿拉颁帕灰(毋えば、ヒグロマイシン卵拉、剩眶挑湿卵拉、ピュ〖ロマイシン アセチルトランスフェラ〖ゼ)もまた、蝗脱され评る。恃构された山附房を瞥掐する戮のマ〖カ〖、毋えば涡咖分各タンパク剂、唆は嘿甩山烫タンパク剂、毋えばCD4, CD8,クラスI MHC、论茸アルカリホスファタ〖ゼが、FACS尸梧唆は姬丹ビ〖ス尸违祷恕のような缄檬により、トランスフェクトされていない嘿甩とトランスフェクトされた嘿甩とを尸梧するために蝗脱され评る。
≮0194≯
Ztnfr12ポリペプチドはまた、ウィルス丁惦システムを脱いて、禽蛙された赢讫梧嘿甩により栏喇され评る。この誊弄のための诺房弄なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス第びアデノ簇息ウィルス∈AAV∷を蜀崔する。アデノウィルス、すなわち企塑嚎DNAウィルスは附哼、佰硷乘焕の丁惦のための呵も甫垫されている颁帕灰トランスファ〖ベクタ〖である∈Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161≥89, 1994; 第びJ. T. Douglas and D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44≥53, 1997 を徊救のこと∷。アデノウィルスシステムの网爬は、孺秤弄络きなDNA赁掐挛の箭推、光い蜗擦に笼浚する墙蜗、弓认跋の赢讫梧嘿甩房を炊厉する墙蜗、第び佰なったプロモ〖タ〖を崔む驴眶の掐缄できるベクタ〖との蝗脱を材墙にする嚼起拉を蜀崔する。
≮0195≯
アデノウィルスゲノムの办婶を风己することによって、佰硷DNAの络きな赁掐挛∈7kbまでの∷が箭推され评る。それらの赁掐挛は、木儡弄な息冯により、唆はトランスフェクトされたプラスミドによる陵票寥垂えにより、ウィルスDNA面に瞥掐され评る。EI颁帕灰が缴肩嘿甩により丁惦されない眷圭、剩澜の痰墙拉をもたらす、ウィルスベクタ〖からの涩寇EI颁帕灰を风己することは扦罢である。毋えば、アデノウィルスベクタ〖≥炊厉されたヒト293嘿甩∈ATCC No. CRL≥1573, 45504, 45505∷は、铜罢な翁のタンパク剂を栏喇するために孺秤弄光い嘿甩泰刨で、烧缅嘿甩として、唆は伏蛮禽蛙湿において笼浚され评る∈Garnierなど., Cytotechnol. 15: 145 (1994) を徊救のこと∷。
≮0196≯
Ztnfr12はまた、戮の光霹靠乘嘿甩、毋えば幕梧、遁梧、韩妙、冠熟、唆は竣湿嘿甩においても券附され评る。バキュロウィルスシステムは、韩妙嘿甩面に、クロ〖ン步されたZtnfr12颁帕灰を瞥掐するための跟蔡弄な缄檬を捏丁する。努磊な券附ベクタ〖は、オ〖トグラファˇカリホルニカ∈Autographa californica∷ 乘驴逞挛陕ウィルス∈AcMNPV∷に答づかれており、そして紊く梦られているプロモ〖タ〖、毋えばショウジョウバエ钱ショックタンパク剂∈hsp∷70プロモ〖タ〖、オ〖トグラファˇカルホルニカ乘驴逞挛陕ウィルス篓箕≥介袋颁帕灰プロモ〖タ〖∈ie-I∷第び觅变された介袋39K プロモ〖タ〖、バキュロウィルスp10プロモ〖タ〖第びジョウジョウバエメタロチオネインプロモ〖タ〖を崔む。
≮0197≯
寥垂えバキュロウィルスを澜陇するための妈2の数恕は、Luckow ( Luckow, VA, など., J. Virol 67: 4566≥79, 1993 ) により淡很されるトランスポゾンに答づくシステムを网脱する。トランスファ〖ベクタ〖を网脱するこのシステムは、Bac≥to≥BacTMキット∈Life Technologies, Rockville, MD∷として辉任されている。このシステムは、∪bacmid∩ と钙ばれる络きなプラスミドとして、E.コリに拜积されるバキュロウィルスゲノム面に、Ztnfr12リガンドポリペプチドをコ〖ドするDNAを败瓢せしめるために、Tn7トランスポゾンを崔むトランスファ〖ベクタ〖、pFastBacI TM (Life Technologies )を网脱する。Hill≥Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971≥6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551≥6, 1994; 第びChazenbalk, G. D., and Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543≥9,1995 を徊救のこと。
≮0198≯
さらに、トランスファ〖ベクタ〖は券附されたZtnfr12ポリペプチドのC≥唆はN≥琐眉でエピト〖プ筛急、毋えばGlu≥Glu エピト〖プ筛急をコ〖ドするDNAとのイン≥フレ〖ム突圭挛を崔むことができる∈Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952≥6, 1985∷。碰度肠において梦られている祷恕を脱いて、Ztnfr12颁帕灰を崔むトランスファ〖ベクタ〖により、E.コリが妨剂啪垂され、そして寥垂えバキュロウィルスの山绩である们鲁弄lacZ颁帕灰を崔むbacmida についてスクリ〖ンされる。寥垂えバキュロウィルスゲノムを崔むbacmid DNA が、奶撅の祷恕を脱いて帽违される。
≮0199≯
毋绩弄なPFASTBACベクタ〖は、陵碰の镍刨まで饯峻され评る。毋えば、涟淡ポリヒドリンプロモ〖タ〖は、近殿され、そしてバキュロウィルス炊厉において玲めに券附され、そして尸如されたタンパク剂を券附するために攻旁圭であることが梦られているバキュロウィルス宾答拉タンパク剂プロモ〖タ〖∈また、Pcor, p6.9唆はMPプロモ〖タ〖としても梦られている∷により弥垂され评る。Hill≥Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971≥6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Virol. 75: 1551≥6, 1994; 第びChazenbalk, G. D., and Rapoport, B., J. Biol Chem. 270: 1543≥9,1995 を徊救のこと。
≮0200≯
そのようなトランスファ〖ベクタ〖菇陇挛においては、宾答拉タンパク剂プロモ〖タ〖の没いか唆は墓いバ〖ジョンが蝗脱され评る。さらに、韩妙タンパク剂に统丸する尸如シグナル芹误により欧脸のZtnfr12尸如シグナル芹误を弥垂しているトランスファ〖ベクタ〖が菇喇さえ评る。毋えば、エクジステロイドˇグルコシルトランスフェラ〖ゼ∈EGT∷、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 唆はバキュロウィルスgp67∈PharMingem, San Diego, CA)からのシグナル芹误は、栏丸のZtnfr12尸如シグナル芹误を弥垂するために、菇陇挛に蝗脱され评る。
≮0201≯
寥垂えウィルス唆はバクミド∈bacmid∷は、缴肩嘿甩をトランスフェクトするために蝗脱される。努磊な韩妙缴肩嘿甩は、IPLB≥Sf≥21に统丸する嘿甩废、スポドプテラフルギペルダ∈Spodoptera frugiperda∷さなぎ婉零嘿甩废、毋えばSf9 (ATCC CRL 1711)、Sf21AE第びSf21∈Invitrogen Corporation; San Diego, CA∷、第びショウジョウバエSchneider≥2嘿甩、事びにトリコプルシアˇニ∈Trichoplusia ni∷に统丸するHIGH FIVEO 嘿甩废∈Invitrogen∷を蜀崔する∈アメリカ泼钓妈5,300,435规∷。
≮0202≯
辉任の缝蓝フリ〖禽孟が、嘿甩の笼浚第び拜积のために蝗脱され评る。努磊な禽孟は、Sf9嘿甩に簇しては、Sf900IITM (Life Technologies) 唆はESF921TM (Expression Systems)〃第びトリコプルシアˇニ嘿甩に簇しては、Ex≥cellO405TM (JRH Biosiences, Lenexa, KS) 唆はExpress FiveOTM (Life Technologies)を蜀崔する。寥垂えウィルスが蝗脱される眷圭、嘿甩は诺房弄には、寥垂えウィルスストックが0.1×10、より诺房弄には、腆3の炊厉の驴脚刨∈MOI∷で藕裁される孟爬で、腆2×5∵105改の嘿甩1×2∵106改の嘿甩の儡硷泰刨で卡寝される。
≮0203≯
バキュロウィルスでの寥垂えタンパク剂を栏喇するための澄惟された祷恕は、Baileyなど., ∪Manipulation of Baculovirus Vectors∩, in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), P. 147-168 (The Humana Press, (nc. 1991) により、Patel など., ∪The buculovirus expression system∩, in DNA Cloing2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.) p.205-244 (Oxford University Press 1995) により、Ausubel (1995) p.16-37×16-57により、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Proteocols (The Humana Press, Inc. 1995) により、第びLucknow, ∪Insect Cell Expression Technology∩, in Protein Engineering: Principles and Practice. Cleland など. (eds.), p.183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) により捏丁される。
≮0204≯
遁梧嘿甩、毋えば冠熟嘿甩はまた、塑汤嘿今に倡绩される颁帕灰を券附するためにも蝗脱され评る。これに簇して、泼に督蹋ある冠熟硷は、サッカロミセスˇセレビシアエ∈Saccharomyces cerevisiae∷, ピチアˇパストリス∈Pichia pastoris∷第びピチアˇメタノリカ(pichia methanolica) を蜀崔する。冠熟における券附のための努磊なプロモ〖タ〖は、GAL1∈ガラクト〖ス∷、PGK∈ホスホグリセリンキナ〖ゼ∷、ADH∈アルコ〖ルデヒドロゲナ〖ゼ∷、AOX1∈アルコ〖ルオキシダ〖ゼ∷、HIS4∈ヒスチジノ〖ルデヒドロゲナ〖ゼ∷第び票屯のものからのプロモ〖タ〖を蜀崔する。
≮0205≯
嘲傍拉DNAによりS. セレビシアエ嘿甩を妨剂啪垂し、そしてそれから寥垂えポリペプチドを栏喇するための数恕は、毋えばKawasaki, アメリカ泼钓妈4,599,311规〃Kawasaki など., アメリカ泼钓妈4,931,373规〃Brake, アメリカ泼钓妈4,870,008规〃Welchなど., アメリカ泼钓妈5,037,743规〃第びMurray など., アメリカ泼钓妈4,845,075规により倡绩される。妨剂啪垂された嘿甩は、联买マ〖カ〖、奶撅、卵挑湿拉、唆は、泼年の鄙蛙湿∈毋えばロイシン∷の稍哼布で笼浚する墙蜗により疯年される山附房により联买される。
≮0206≯
サッカロミセスˇセレビシアエへの蝗脱のための攻ましいベクタ〖システムは、グルコ〖ス崔铜禽孟における笼浚により妨剂啪垂された嘿甩の联买を材墙にする、Kawasaki など. (アメリカ泼钓妈4,931,373规)により倡绩されるPOT1ベクタ〖システムである。冠熟への蝗脱のための努磊なプロモ〖タ〖第びタ〖ミネ〖タ〖は、豺劈废冠燎颁帕灰∈毋えば、Kawasaki, アメリカ泼钓妈4,599,311规〃Kingsmanなど., アメリカ泼钓妈4,615,974规〃第びBitter, アメリカ泼钓妈4,977,092 规を徊救のこと∷第びアルコ〖ル デヒドロゲナ〖ゼ颁帕灰からのものを蜀崔する。また、アメリカ泼钓妈4,990,446 规〃妈5,063,154规〃妈5,139,936 规〃第び妈4,661,454规を徊救のこと。
≮0207≯
戮の冠熟、毋えばハンセヌラˇポリモルファ∈Hansenula polymorpha∷、シゾサッカロミセスˇポンベ∈ Schizosaccharomyces pombe ∷、クルイベリミセスˇラクチス∈ Kluyveromyces lactis ∷、クルイベリミセスˇフラギリス∈Kluyveromyces fragilis ∷、ウスチラゴˇマイジス∈Ustilago maydis ∷、ピチアˇパストリス∈ Pichia pastoris ∷、ピチアˇメタノリカ∈Pichia methanolica∷、ピチアˇグイレルモンジ∈ Pichia guillermondii ∷、第びカンジタˇマルトサ∈Candida maltosa ∷のための妨剂啪垂システムは、碰度肠において梦られている。
≮0208≯
毋えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459≥3465, 1986 第びCregg, アメリカ泼钓妈4,882,279 规を徊救のこと。アスペルギラス嘿甩は、Mcknight など.,アメリカ泼钓妈4,935,349规の数恕に骄って蝗脱され评る。アクレモニウムˇクリソゲナム∈Acremonium chrysogenum∷を妨剂啪垂するための数恕は、Sumino ., アメリカ泼钓妈5,162,228规により倡绩される。ニュ〖ロスポラ∈Neurospora∷を妨剂啪垂するための数恕は、Lambowitz, アメリカ泼钓妈4,486,533规により倡绩される。
≮0209≯
毋えば、寥垂えタンパク剂の栏喇のための缴肩としてのピチアˇメタノリカの蝗脱は、Raymond、アメリカ泼钓妈5,716,808规、Raymond、アメリカ泼钓妈5,736,383规、Raymondなど.,Yeast 14: 11-23 (1998)、第びWIPO给倡WO97】17450, WO97】17451、WO98】02536第びWO98】02565に倡绩される。P.メタノリカの妨剂啪垂に蝗脱するためのDNA尸灰は奶撅、妨剂啪垂の涟、攻ましくは俐觉步される、企塑嚎の茨觉プラスミドとして拇澜されるであろう。P.メタノリカにおけるポリペプチド栏喇のためには、プラスミドにおけるプロモ〖タ〖第びタ〖ミネ〖タ〖は、P.メタノリカ颁帕灰、毋えばP.メタノリカ アルコ〖ル网脱颁帕灰∈AUG1唆はAUG2∷のものであることが攻ましい。
≮0210≯
戮の铜脱なプロモ〖タ〖は、ジヒドロキシアセトンシンタ〖ゼ∈DHAS∷、ギ焕デヒドロゲナ〖ゼ∈FMD∷、第びカタラ〖ゼ∈CAT∷颁帕灰のものを蜀崔する。缴肩厉咖挛面へのDNAの寥み哈みを楼渴するためには、缴肩DNA芹误を尉眉に铜するプラスミドの窗链な券附セグメントを铜することが攻ましい。ピチア メタノリカへの蝗脱のための攻ましい联买マ〖カ〖は、アデニンの稍哼布でade2缴肩嘿甩の笼浚を材墙にする、ホスホリボシル≥5≥アミノイミダゾ〖ルカルボキシラ〖ゼ∈AIRC; EC. 4.1.1.21∷をコ〖ドするP.メタノリカADE2颁帕灰である。メタノ〖ルの蝗脱を呵警にすることが疥司される络惮滔缓度数恕のためには、尉メタノ〖ル网脱颁帕灰∈AUG1第びAUG2∷が风己されている缴肩嘿甩を蝗脱することが攻ましい。
≮0211≯
尸如されたタンパク剂の栏喇のためには、闭甩プロテア〖ゼ颁帕灰∈PEP4第びPRB1∷を风いている缴肩嘿甩が攻ましい。エレクトロポレ〖ションが、P.メタノリカ嘿甩面への、督蹋あるポリペプチドをコ〖ドするDNAを崔むプラスミドの瞥掐を楼渴するために蝗脱される。2.5×4.5kV/cm,攻ましくは腆3.75kV/cmの排眷の动さ、第び1×40m擅、呵も攻ましくは腆20m擅の箕年眶∈t∷を铜する、回眶弄に负筷する、パルスされた排眷を脱いて、エレクトロポレ〖ションによりP.メタノリカ嘿甩を妨剂啪垂することが攻ましい。
≮0212≯
券附ベクタ〖はまた、竣湿プロトプラスト、禄なわれていない竣湿寥骏唆は帽违された竣湿嘿甩面にも瞥掐され评る。竣湿寥骏面に券附ベクタ〖を瞥掐するための数恕は、アグロバクテリウムˇツメファシエンス∈Agrobacterium tumefaciens∷、マイクロプロジェクティル≥拆哼拉丁惦、DNA庙纪、エレクトロポレ〖ション第び票屯のものによる竣湿寥骏の木儡弄な炊厉唆はそれらと鼎にs竣湿嘿甩の票箕禽蛙を蜀崔する。毋えば、Horschなど., Science 227¨1229 (1995)、Kleinなど., Biotechnology 10: 268 (1992) 第びMikiなど., ∪Procedures for Intoducing Foreign DNA into Plants∩, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick など. (eds.), P.67-88 (CRC Press, 1993) を徊救のこと。
≮0213≯
戮数では、Ztnfr12颁帕灰は、付乘缴肩嘿甩において券附され评る。付乘嘿甩においてZtnfr12ポリペプチドを券附するために蝗脱され评る努磊なプロモ〖タ〖は、碰度荚に紊く梦られており、そしてT4, T3, Sp6第びT7ポリメラ〖ゼを千急できるプロモ〖タ〖、バクテリオファ〖ジλのPR第びPLプロモ〖タ〖、E.コリのtrp, recA, 钱ショック、lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA第びlacZプロモ〖タ〖、B.スブチリスのプロモ〖タ〖、バチルスのバクテリオファ〖ジのプロモ〖タ〖、ストレプトミセスプロモ〖タ〖、バクテリオファ〖ジλのintプロモ〖タ〖、pBR322のblaプロモ〖タ〖第びクロラムフェニコ〖ルアセチルトランスフェラ〖ゼ颁帕灰のCATプロモ〖タ〖を蜀崔する。付乘プロモ〖タ〖は、Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watsonなど., molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 第びAusubelなど. (1995) により浩雇されている。
≮0214≯
努磊な付乘缴肩は、E.コリ第びバチルスˇスブチリス∈Bacillus subtilis∷を蜀崔する。E.コリの努磊な臭は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F, DH51MCR, DH 10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451第びER1647を蜀崔する∈毋えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) を徊救のこと∷。バチルスˇスブチリスの努磊な臭は、BR151、YB886、MI119、MI120第びBI70を蜀崔する∈毋えば、Hardy, ∪Bacillus Cloning Methods∩, in DNA Cloning: A Practical Approach, Clover (ed.) (IRL Press 1985) を徊救のこと。
≮0215≯
嘿遁、毋えばE.コリにおいてZtnfr12ポリペプチドを券附する眷圭、そのポリペプチドは、诺房弄には稍拖拉瘗纬として嘿甩剂に瘦积され评、唆は嘿遁の尸如芹误により嘿甩件收剐に羹けられ评る。涟荚の眷圭、嘿甩は拖豺され、そして瘗纬が搀箭され、そして毋えばグアニジンイソチオシアネ〖ト唆はウレアを脱いて恃拉される。肌に、恃拉されたポリペプチドが浩栏され、そして毋えばウレア、第び丛傅された第び焕步されたグルタチオンの寥み圭わせの拖闭に滦する譬老、鲁く此咀拖闭に滦する譬老により、涟淡恃喇挛を歹坚することによってニ翁挛步され评る。稿荚の眷圭、ポリペプチドは、嘿甩件收剐の柒推湿を倡庶するために嘿甩を撬蝉し∈毋えば、不侨借妄唆は炕譬ショックにより∷、そしてタンパク剂を搀箭することによって、嘿甩件收剐から材拖拉第び怠墙拉妨で搀箭され、それにより、恃拉第び浩栏のための涩妥拉を搀闰することができる。
≮0216≯
付乘缴肩においてタンパク剂を券附するための数恕は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Williamsなど., ∪Expression of foreign protein in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies∩ in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), P.15 (Oxford University Press 1995), Ward など., ∪Genetic Manipulation and Expression of Antibodies∩ in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 第びGeorgiou, ∪Expression of Proteins in Bacteria∩, in Protein Engineering: Principles and Practice; Cleland など. (eds.), p101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) を徊救のこと∷。
≮0217≯
嘿遁、冠熟、韩妙第び竣湿嘿甩面に券附ベクタ〖を瞥掐するための筛洁数恕は、Ausubel (1995) により捏丁される。
赢讫梧嘿甩废により栏喇される嘲丸拉タンパク剂を券附し、そして搀箭するための办忍弄数恕は、毋えばEtcheverry, ∪Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture ∪in Protein Englineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), p163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) により捏丁される。
≮0218≯
嘿遁废により栏喇されるタンパク剂を搀箭するための筛洁祷恕は、毋えばGrisshammer など., ∪Purification of Over-Produced proteins from E.coli cells ∪in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), p.59-92 (Oxford University Press 1995) により捏丁される。バキュロウィルス废から寥垂えタンパク剂を帽违するための澄惟された数恕は、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) により淡很される。
≮0219≯
戮数では、塑券汤のポリペプチドは、迫狸弄盖陵圭喇、婶尸盖陵数恕、フラグメント教圭唆は骄丸の拖闭圭喇により圭喇され评る。それらの圭喇数恕は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., ∪Solid Phase Peptide Synthesis∩ (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. 3.3 (1986). Atherton など., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989). Fields and Colowick, ∪Solid-Phase Peptide Synthesis.∩ Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 第び Lloyd-Williams など., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を徊救のこと∷。
≮0220≯
链挛弄な步池圭喇数恕、毋えば∪栏丸の步池弄息冯∩第び∪券附されたタンパク剂息冯∩における恃瓢拉もまた筛洁である∈毋えば、Dawsonなど., Science 266: 776 (1994), Hackengなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir など., proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 6705 (1998),第び Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)を徊救のこと∷。
≮0221≯
塑券汤のペプチド第びポリペプチドは、芹误戎规2の警なくとも6改、警なくとも9改唆は警なくとも15改の息鲁したアミノ焕荒答を崔んで喇る。毋绩として、ポリペプチドは、芹误戎规2のアミノ焕芹误のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79のアミノ焕荒答の警なくとも6、警なくとも9唆は警なくとも15改の息鲁したアミノ焕荒答を崔んで喇る。塑券汤の1つの轮屯においては、ポリペプチドは、それらのアミノ焕芹误の20改·30改·40改·50改·100改唆はそれ笆惧の息鲁した荒答を崔んで喇る。
≮0222≯
毋えば、ポリペプチドは、肌のアミノ焕荒答から喇る凡から联买されたアミノ焕芹误の警なくとも30改の息鲁したアミノ焕荒答を崔んで喇る¨∈a∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥184、∈b∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、∈c∷芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、∈d∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、第び∈e∷芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79。そのようなペプチド第びポリペプチドをコ〖ドする乘焕尸灰は、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳プライマ〖第びプロ〖ブとして铜脱であり、そしてそれらのペプチド第びポリペプチドはZtnfr12に滦する钩挛を栏喇するために铜脱である。
≮0223≯
6ˉZtnfr12突圭タンパク剂第び儡圭挛の栏喇
1つの办忍弄な硷梧のZtnfr12梧击挛は、塑汤嘿今に倡绩されるアミノ焕芹误の仆脸恃佰であるアミノ焕芹误を铜する恃佰挛である。もう1つの办忍弄硷梧のZtnfr12梧击挛は、布淡のように、钩≥イディオタイプ钩挛第びそのフラグメントにより丁惦される。さらに、钩≥イディオタイプの材恃ドメインを崔んで喇る寥垂え钩挛が、梧击挛として蝗脱され评る∈毋えば、Monfardiniなど., proc. Assoc. Am. Physicians 108: 420 (1996) を徊救のこと∷。钩≥イディオタイプZtnfr12钩挛の材恃ドメインはZtnfr12を滔曙するので、それらのドメインは、Ztnfr12冯圭宠拉を捏丁することができる。、钩≥イディオタイプ卡寝拉钩挛を栏喇するための数恕は、碰度荚に梦られている∈毋えば、Joronなど., Ann. N. Y. Acad. Sci. 672:216(1992), Fribouletなど., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229(1994),第びAvalleなど., Ann. N. Y. Acad. Sci.864:118(1998)を徊救のこと∷。
≮0224≯
Ztnfr12梧击挛を票年するもう1つのアプロ〖チは、冯圭ライブラリ〖の蝗脱により捏丁される。ファ〖ジ山绩第び戮の冯圭ライブラリ〖を菇喇し、そしてスクリ〖ニングする数恕は、毋えばKayなど., Phage Display of Peptide and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, アメリカ泼钓妈5,783,384规、Kay, など., アメリカ泼钓妈5,747, 334规第びKauffmanなど., アメリカ泼钓妈5,723,323规により捏丁される。
≮0225≯
Ztnfr12ポリペプチドは、インビボ第びインビトロの尉荚において蝗脱される。毋绩として、Ztnfr12の材拖妨が、禽蛙された嘿甩により栏喇されるか、唆は活赋禽孟に藕裁されるZtnfr12の跟蔡を了巢するために、嘿甩禽蛙禽孟に藕裁され评る。
≮0226≯
Ztnfr12の突圭タンパク剂は、寥垂え缴肩においてZtnfr12を券附するために、そして券附されたZtnfr12を帽违するために蝗脱され评る。布淡に淡很されるように、泼年のZtnfr12突圭タンパク剂はまた、壳们第び迹闻にも蝗脱される。1つのタイプの突圭タンパク剂は、寥垂え缴肩嘿甩からのZtnfr12ポリペプチドを捌柒するペプチドを崔んで喇る。Ztnfr12ポリペプチドを、靠乘嘿甩の尸如沸烯面に数羹づけるためには、尸如シグナル芹误∈また、シグナルペプチド、リ〖ダ〖芹误、プレプロ芹误唆はプレ芹误としても梦られている∷が、Ztnfr12券附ベクタ〖に丁惦される。
≮0227≯
尸如シグナル芹误はZtnfr12に统丸するが、努磊なシグナル芹误はまた、もう1つの尸如されたタンパク剂から投瞥されるか、唆は糠たに圭喇され评る。尸如シグナル芹误は、Ztnfr12≥コ〖ド芹误に侯脱材墙に息冯され、すなわち2つの芹误は赖しく粕み艰り先を腊圭して息冯され、そして缴肩嘿甩の尸如沸烯面に糠しく圭喇されたポリヌクレオチドを数羹づけるように芹弥される。尸如シグナル芹误は奶撅、督蹋あるポリペプチドをコ〖ドするヌクレオチド芹误の5∏ 娄に疤弥するが、芒し办年の尸如シグナル芹误は、督蹋あるヌクレオチド芹误の戮の眷疥に疤弥することもできる∈毋えば、Welchなど.,アメリカ泼钓妈5,037,743规〃Hollandなど., アメリカ泼钓妈5,143,830规を徊救のこと∷。
≮0228≯
Ztnfr12唆は赢讫梧嘿甩により栏喇されるもう1つのタンパク剂∈毋えば、アメリカ泼钓妈5,641,655规に淡很されるような寥骏タイプのプラスミノ〖ゲン宠拉步傍灰シグナル芹误∷は、寥垂え赢讫梧缴肩におけるZtnfr12の券附のために铜脱であるが、冠熟シグナル芹误は、冠熟嘿甩における券附のために铜脱である。努磊な冠熟シグナル芹误の毋は、冠熟滦圭附据α≥傍灰∈MFα1颁帕灰によりコ〖ドされる∷、インバ〖タ〖ゼ∈SUC2颁帕灰によりコ〖ドされる∷唆は焕拉ホスファタ〖ゼ∈PHO颁帕灰によりコ〖ドされる∷に统丸するそれらのものである。毋えば·Romanos など., ∪Expression of Cloned Genes in Yeast∩ in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), p.123-167 (Oxford University Press 1995) を徊救のこと。
≮0229≯
嘿遁嘿甩においては、魄拉を你め、奥年拉を光め、そして券附されたタンパク剂の搀箭拉を光めるために、佰硷タンパク剂を突圭タンパク剂として券附することが、しばしば疥司される。毋えばZtnfr12は、グルタチオンS≥トランスフェラ〖ゼポリペプチドを崔んで喇る突圭タンパク剂として券附され评る。グルタチオンS≥トランスフェラ〖ゼ突圭タンパク剂は、诺房弄には、材拖拉であり、そして盖年されたグルタチオンカラム惧でE. コリ突豺湿から推白に篮澜できる。梧击するアプロ〖チにおいては、マルト〖ス冯圭タンパク剂ポリペプチドを崔んで喇るZtnfr12突圭タンパク剂は、アミロ〖ス践婚カラムにより帽违され评、そして磊们されたタンパク剂A颁帕灰のC≥琐眉を崔んで喇る突圭タンパク剂は、IgG≥セファロ〖スを脱いて篮澜され评る。
≮0230≯
嘿遁嘿甩において佰硷ポリペプチドを、突圭タンパク剂として券附するために澄惟された祷恕は、Williamsなど., ∪Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies∩, in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), p.15-58 (Oxford University Press 1995) により淡很される。さらに、辉任の券附システムが网脱できる。毋えば、PINPOINT Xaタンパク剂篮澜システム∈Promega Corporation, Madison, WI∷は、アビジンを崔んで喇る践婚により、券附の粗、ビオチニル步されるポリペプチドを崔んで喇る突圭タンパク剂を帽违するための数恕を捏丁する。
≮0231≯
付乘唆は靠乘嘿甩により券附される佰硷ポリペプチドを帽违するために铜脱であるペプチド筛急は、ポリヒスチジン筛急∈ニッケル≥キレ〖ト步践婚に滦する科下拉を铜する∷、c-myc筛急、カルモジュリン冯圭タンパク剂∈カルモジュリン科下拉クロマトグラフィ〖により帽违される∷、湿剂P, RYIRS 筛急∈钩≥RYIRS钩挛と冯圭する∷、Gln≥Gln筛急第びFLAG筛急∈钩≥FLG钩挛と冯圭する∷を蜀崔する。毋えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 第びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を徊救のこと。そのようなペプチド筛急コ〖ドする乘焕尸灰は、毋えばSigma≥Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から掐缄できる。
≮0232≯
もう1つの妨の突圭タンパク剂は、Ztnfr12ポリペプチド、第び2唆は3改の剩挝拌ドメイン第びヒンジ挝拌を崔むが、しかし材恃挝拌を风いている倘敝グロブリンH嚎稍恃挝拌、诺房弄なFcフラグメントを崔んで喇る。Ztnfr12喇尸第びFc喇尸を崔んで喇る突圭タンパク剂は、インビトロアッセイ缄檬として蝗脱され评る。毋えば栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12リガンドの赂哼は、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂を脱いて浮叫され评、ここでZtnfr12喇尸は、涟淡リガンド、第び光尸灰、毋えばタンパク剂A唆は钩≥Fc钩挛を冯圭するために蝗脱され、すなわち盖挛毁积挛に突圭タンパク剂を冯圭するために蝗脱される。さらに、そのようなシステムは、Ztnfr12リガンドのその减推挛への冯圭を烁巢するアゴニスト第びアンタゴニストを票年するために蝗脱され评る。
≮0233≯
毋绩のように、Chang など., (アメリカ泼钓妈5,723,125规) は、ヒトインタ〖フェロン第びヒト倘敝グロブリンFcフラグメントを崔んで喇る突圭タンパク剂を淡很する。インタ〖フェロンのC≥琐眉は、ペプチドリンカ〖喇尸によりFcフラグメントのN≥琐眉に息冯される。ペプチドリンカ〖の毋は、倘敝池弄に稍宠拉であるT嘿甩稍宠拉芹误を肩に崔んで喇るペプチドである。诺房弄なペプチドリンカ〖は、アミノ焕芹误¨GGSGG SGGG SGGGG S (芹误戎规4) を铜する。突圭タンパク剂においては、攻ましいFc喇尸は、拖闭において奥年拉であり、そして宠拉を宠拉步する输挛をほとんど铜さないか唆は窗链に铜さないヒトγ嚎である。
≮0234≯
骄って、塑券汤はZtnfr12喇尸第びヒトFcフラグメントを崔んで喇るZtnfr12突圭タンパク剂を措茶し、ここで涟淡Ztnfr12喇尸のC≥琐眉は、ペプチドリンカ〖、毋えば芹误戎规4のアミノ焕芹误から喇るペプチドを奶してFcフラグメントのN≥琐眉に冯圭される。Ztnfr12喇尸は、Ztnfr12尸灰唆はそのフラグメントであり评る。毋えば、突圭タンパク剂は、Fcフラグメント∈毋えば、ヒトFcフラグメント∷、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、第び芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79を崔んで喇ることができる。
≮0235≯
もう1つの轮屯においては、Ztnfr12突圭タンパク剂は、IgG芹误、IgG Ztnfr12のアミノ焕琐眉に鼎铜冯圭されるZtnfr12喇尸、第びZtnfr12のアミノ焕琐眉に鼎铜冯圭されるシグナルペプチドを崔んで喇り、ここで涟淡IgG芹误は、肌の界进での肌の妥燎から喇る¨CH2ドメイン第びCH3ドメイン。骄って、IgG芹误はCH1ドメインを风いている。Ztnfr12喇尸は、塑汤嘿今に淡很されるように、Ztnfr12宠拉、毋えばZtnfr12リガンドと冯圭する墙蜗を绩す。钩挛第び润钩挛婶尸の尉荚を崔んで喇る突圭タンパク剂を栏喇するこの办忍弄なアプロ〖チは、LaRochelleなど., ヨ〖ロッパ泼钓妈742830规∈WO95/21258规∷により淡很されている。
≮0236≯
毋4は、IgG统丸の倘敝グロブリンが办年の仆脸恃佰を崔む、Ztnfr12突圭タンパク剂の菇喇を淡很する。5硷の倘敝グロブリンIgG, IgA, IgM, IgD第びIgEが光霹涝那瓢湿において票年されている。IgG, IgD第びIgEタンパク剂は、2硷の票办のH嚎第び2硷の票办のL嚎からなる、泼魔弄にジスルフィド冯圭されたヘテロテトラマ〖である。诺房弄には、IgMはテトラマ〖のペンタマ〖として斧叫され、そしてIgAはテトラマ〖のダイマ〖として赂哼する。
≮0237≯
IgGは、それが缝搦に斧叫される妈2の呵も驴くのタンパク剂として奶撅、赂哼する眷圭、肩脱クラスを蜀崔する。ヒトにおいては、IgGは、IgG1, IgG2, IgG3第びIgG4と疚する4硷のサングラスから喇る。哭1に绩されるように、改」の倘敝グロブリンH嚎は、疥年のサブクラスのために稍恃である稍恃挝拌タンパク剂ドメイン∈CH1、ビンジ、CH2第びDH3∷から喇る稍恃挝拌を铜する。IgGクラスのH嚎稍恃挝拌は、ギリシア淡规γにより票年される。毋えば、IgG1サブクラスの倘敝グロブリンは、γ1H嚎稍恃挝拌を崔む。
≮0238≯
Fcフラグメント唆はFcドメインは、ジスルフィド冯圭されたH嚎ヒンジ挝拌、CH2第びCH3ドメインから喇る。倘敝グロブリン突圭タンパク剂においては、IgG1サングラスのFcドメインは、IgG1が缝蓝タンパク剂のいずれかの呵墓の缝蓝染负袋を铜するので、しばしば倘敝グロブリン喇尸として蝗脱される。墓い缝蓝染负袋は、瓢湿甫垫第び材墙拉あるヒト迹闻蝗脱のための泼魔弄な疥司するタンパク剂であり评る。さらに、IgG1サブクラスは、钩挛拆哼拉エフェクタ〖怠墙を悸卉する呵墓の跟蜗を铜する。
≮0239≯
倘敝グロブリン突圭タンパク剂において呵も铜脱であり评る肩妥エフェクタ〖怠墙は、钩挛巴赂拉嘿甩魄拉を拆哼するIgG1钩挛についての墙蜗である。戮数では、これは、肩妥怠墙がアンタゴニストとして赂哼する突圭タンパク剂の疥司しない怠墙であり评る。IgG1サングラスにおける钩挛稍恃挝拌拆哼拉宠拉のために脚妥である泼佰弄アミノ焕荒答のいくつかが票年されている。骄って、それらの泼佰弄アミノ焕の蜀崔唆は怯近は、泼佰弄倘敝グロブリン稍恃挝拌拆哼宠拉の蜀崔唆は怯近を材墙にする。
≮0240≯
毋4は、Ztnfr12≥Fc突圭タンパク剂を料陇するために栏喇された、饯峻されたヒトIgG1 Fcの2硷のバ〖ジョンを淡很する。Fc4第びFc5は、FcγRI冯圭第び输挛C1q冯圭を你めることによって、Fcにより拆哼されるエフェクタ〖怠墙を你めるための仆脸恃佰を崔む。泼に、3硷のアミノ焕弥垂が、EcγR1冯圭を你めるために瞥掐された。それらは、EUインデックス疤弥234第び237∈填栏房倘敝グロブリンγI挝拌の芹误である、芹误戎规17のアミノ焕荒答38、 39第び41∷での弥垂である。それらの疤弥での弥垂は、FcγRIへの冯圭を你めることが绩されている∈Duncanなど., Nature 332: 563 (1988)∷。それらのアミノ焕弥垂はまた、FcγRIIa冯圭、第びFcγRIII冯圭も你めることができる∈Sondermannなど., Nature 406: 267 (2000); winesなど., J. Immunol. 164: 5313 (2000)∷。
≮0241≯
いくつかのグル〖プが、输挛C1q冯圭第び鲁く输挛盖年におけるEUインデックス疤弥330第び331∈芹误戎规17のアミノ焕荒答134第び135∷の努磊拉を淡很している∈Cafield and Mirrison, J. Exp. Med. 173: 1483 (1991); Taoなど., J. Exp. Med. 178: 1661 (1993)∷。それらの疤弥でのアミノ焕弥垂は、输挛盖年步を你めるためにFc4において瞥掐された。Fc4のCH3ドメインは、その滦炳する填栏房ポリペプチドにおいて斧叫されるそのドメインと票办であるが、芒しクロ〖ン步されたDNAがdam≤Eˉコリの臭において笼浚される眷圭、材墙拉あるdamメチル步婶疤を怯近するためにTGAからTAAに恃构される匿贿コドンを近く。
≮0242≯
Fc5においては、EUインデックス疤弥218でのアルギニン荒答は、BglIIクロ〖ニングスキ〖ムがこの泼年のFcを崔む突圭タンパク剂において蝗脱されなかったので、リシンに仆脸恃佰された。Fc5芹误の荒りは、Fc4についての惧淡の淡很に努圭する。
≮0243≯
戮の铜脱なFc恃佰挛は、Fc6、Fc7第びFc8を蜀崔する。Fc6はFc5と票办であるが、芒し、カルボキシル琐眉リシンコドンが怯近されていることを近く。喇较倘敝グロブリンのC琐眉リシンはしばしば、B嘿甩からの尸如の涟、喇较倘敝グロブリンから稿≥溯条弄に近殿されるか、唆は缝蓝桔茨の粗、近殿される。骄って、C琐眉リシン荒答は诺房弄には、桔茨钩挛惧では斧叫されない。惧淡Fc4第びFc5に簇しては、Fc6芹误における匿贿コドンは、TAAに恃构されている。
≮0244≯
Fc7は填栏房γ1 Fcと票办であるが、芒しCH2ドメインに疤弥するEUインデックス疤弥297でのアミノ焕弥垂を近く。EUインデックス疤弥Asn≥297∈芹误戎规17のアミノ焕荒答101∷は、N≥息冯された煤垮步湿冯圭の婶疤である。N≥冯圭された煤垮步湿は、その煤垮步湿菇陇における材墙拉あるバッチからバッチへの恃瓢のために、寥垂え券附されたタンパク剂への材墙拉ある恃瓢拉の富を瞥掐している。この材墙拉ある恃瓢拉を怯近する活みにおいては、Asn≥297が、その荒答疤弥でN≥冯圭された煤垮步湿の冯圭を烁げるためにグルタミン荒答に仆脸恃佰投券された。荒答297での煤垮步湿はまた、FcγRIIIに冯圭するFcにも蜀崔される∈Sondermannなど., Nature 406: 267 (2000)∷。骄って、煤垮步湿の近殿は、突圭タンパク剂を崔む寥垂えFc7のFcγRへの冯圭を办忍弄に你める。惧淡のように、Fc7芹误のおける匿贿コドンは、TAAに仆脸恃佰投券された。
≮0245≯
Fc8は、芹误戎规17に绩される填栏房倘敝グロブリンγ1挝拌と票办であるが、芒し、EUインデックス疤弥220でのシステイン荒答∈芹误戎规17のアミノ焕荒答24∷がセリン荒答により弥垂されている。この仆脸恃佰は、倘敝グロブリンL嚎稍恃挝拌と奶撅、ジスルフィド冯圭するシステイン荒答を怯近した。
≮0246≯
塑券汤は、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥39、芹误戎规2のアミノ焕荒答19≥35、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥39から喇るZtnfr12减推挛喇尸を崔んで喇るZtnfr12≥倘敝グルブリン突圭タンパク剂を措茶する。より办忍弄には、塑券汤は、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂を蜀崔し、ここで涟淡Ztnfr12减推挛喇尸は、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥71、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79のフラグメントから喇り、そして涟淡Ztnfr12减推挛喇尸はZTNF4で冯圭する。
≮0247≯
塑汤嘿今に淡很される突圭タンパク剂の倘敝グロブリン喇尸は、倘敝グロブリンの警なくとも1つの稍恃挝拌を崔んで喇る。攻ましくは、倘敝グロブリン喇尸は、ヒト倘敝グロブリンのセグメントを山す。ヒト倘敝グルブリン芹误は、惧淡で侠じられたアミノ焕仆脸恃佰の警なくとも1つを铜する、填栏房アミノ焕芹误、唆は饯峻された填栏房アミノ焕芹误であり评る。
≮0248≯
ヒト倘敝グロブリンアミノ焕芹误はまた、贷梦のアロタイプ疯年答の泼魔である1唆は剩眶の仆脸恃佰を铜することによって填栏房とは佰なることができる。山5は、ヒトIgGγI稍恃挝拌のアロタイプ疯年答を绩す∈Putman, The Plasma Proteins, Vol. V. Pages49 to 140 (Academic Press, Inc. 1987)∷。EUインデックス疤弥214, 356, 358第び431は、贷梦のIgGγ1アロタイプを年盗する。疤弥214は、IgGγ1稍恃挝拌のCH1ドメインに赂哼し、そして骄って、Fc芹误笆柒に赂哼しない。芹误戎规17の填栏房Fc芹误は、Glm∈1∷第びGlm∈2≥∷アロタイプを蜀崔する。しかしながら、TACI≥Fcタンパク剂のFc喇尸は、それらのアロタイプのいずれかの寥み圭わせを山すために饯峻され评る。
≮0249≯
≮山5≯


≮0250≯
塑汤嘿今において倡绩されるZtnfr12≥F2タンパク剂の毋は、ヒトIgI稍恃挝拌を倡绩する。しかしながら、努磊な倘敝グロブリン喇尸はまた、警なくとも1つの稍恃挝拌、毋えば肌の倘敝グロブリンのいずれか、すなわちIgG2, IgG2, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE第びIgMからのH嚎稍恃挝拌を崔んで喇るプロペプチドを蜀崔する。塑券汤はまた、Ztnfr12ダイマ〖第びマルチマ〖を栏喇するために、惧淡のようなZtnfr12减推挛喇尸、第びアルブミン唆はβ2≥マイクログロブリンのいずれか、第び票屯のものを崔んで喇る突圭タンパク剂にも簇する。Ztnfr12突圭タンパク剂ダイマ〖第びマルチマ〖を栏喇するために努磊な纳裁のタンパク剂の喇尸は、碰度荚に梦られている。
≮0251≯
办年の觉轮の借妄においては、Ztnfr12≥倘敝グルブリン突圭タンパク剂と、TACI≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂第びBCMA≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂の警なくとも1つとを寥圭すことは攻旁圭である。この寥圭せ闻恕は、硷」のタイプの倘敝グロブリン突圭タンパク剂を、毋えばダイマ〖として抨涂することによって、唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン、TACI≥倘敝グロブリン第びBCMA≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂のへテロダイマ〖を抨涂することによって茫喇され评る。
≮0252≯
塑券汤の突圭タンパク剂は、办塑嚎ポリペプチド、ダイマ〖、トリマ〖、唆は剩眶のダイマ〖唆はトリマ〖の妨を铜することができる。ダイマ〖は、ホモダイマ〖唆はヘテロダイマ〖であり评、そしてトリマ〖はホモトリマ〖唆はヘテロトリマ〖であり评る。ヘテロダイマ〖の毋は、Ztnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチド第びBCMA≥倘敝グロブリンポリペプチドのダイマ〖、Ztnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチド第びTACI≥倘敝グロブリンポリペプチドのダイマ〖、第びBCMA≥倘敝グロブリンポリペプチド第びTACI≥倘敝グルブリンポリペプチドのダイマ〖を蜀崔する。
≮0253≯
ヘテロポリマ〖の毋は、Ztnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチド第び2硷のBCMA≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、Ztnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチド第び2硷のTACI≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、BCMA≥倘敝グロブリンポリペプチド第び2硷のZtnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、2硷のTACI≥倘敝グロブリンポリペプチド第びBCMA≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、1つのTACI≥倘敝グロブリンポリペプチド第び2硷のZtnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、2硷のBCMA≥倘敝グロブリンポリペプチド第びTACI≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖、第びTACI≥倘敝グロブリンポリペプチド、BCMA≥倘敝グロブリンポリペプチド第びZtnfr12≥倘敝グロブリンポリペプチドのトリマ〖を蜀崔する。
≮0254≯
そのような突圭タンパク剂においては、TACI减推挛喇尸は、芹误戎规8の肌のアミノ焕芹误の警なくとも1つを崔んで喇ることができる¨アミノ焕荒答30≥154、アミノ焕荒答34≥66、アミノ焕荒答71≥104、アミノ焕荒答47≥62第びアミノ焕荒答86≥100。BCMA减推挛喇尸は、芹误戎规7の肌のアミノ焕芹误の警なくとも1つを崔んで喇ることができる¨アミノ焕荒答1≥48、アミノ焕荒答8≥41第びアミノ焕荒答21≥37。Ztnfr12减推挛喇尸は、芹误戎规2の肌のアミノ焕芹误の警なくとも1つを崔んで喇ることができる¨アミノ焕荒答7≥69、アミノ焕荒答19≥35、アミノ焕荒答1≥69、アミノ焕荒答7≥79、アミノ焕荒答1≥71、アミノ焕荒答7≥71唆はアミノ焕荒答1≥39。
≮0255≯
倘敝グロブリン突圭タンパク剂は、筛洁の数恕を脱いて栏喇され评る。毋绩として、毋4は、毋绩弄なZtnfr12≥Fc5突圭タンパク剂を菇喇するために蝗脱され评るPCR数恕の蝗脱を淡很する。
钩挛突圭タンパク剂の戮の毋は、钩付≥冯圭ドメイン、第びZtnfr12嘿甩嘲ドメインを崔むZtnfr12フラグメントを崔んで喇るポリペプチドを蜀崔する。そのような尸灰は、Ztnfr12冯圭宠拉の铜弊拉のための泼年の寥骏を筛弄步するために蝗脱され评る。
≮0256≯
塑券汤はさらに、硷」の戮のポリペプチド突圭挛を捏丁する。毋えば、栏湿池弄怠墙を烧涂するドメインの办婶唆はすべては、拣徵蝉秽傍灰减推挛ファミリ〖の戮のメンバ〖からの怠墙弄に票霹のドメインにより塑券汤のZtnfr12粗で弥垂され评る。ポリペプチド突圭挛は、Ztnfr12突圭梧击挛を栏喇するために、寥垂え缴肩嘿甩において券附され评る。Ztnfr12ポリペプチドは、剩眶の喇尸唆はドメイン、毋えば篮澜の科下拉筛急第び筛弄步ドメインに突圭され评る。ポリペプチド突圭挛はまた、泼にドメイン粗での1唆は剩眶の磊们婶疤を崔むことができる。毋えば、Tuanなど., Connective Tissue Research 34; 1(1996) を徊救のこと。
≮0257≯
突圭タンパク剂は、その突圭タンパク剂の改」の喇尸を拇澜し、そしてそれらを步池弄に儡圭することによって、碰度荚に梦られている数恕により拇澜され评る。戮数では、赖しく粕み艰り先を腊圭して突圭タンパク剂の尉喇尸をコ〖ドするポリヌクレオチドは、贷梦の祷恕を脱いて栏喇され、そして塑汤嘿今に淡很される数恕により券附され评る。突圭タンパク剂の冠燎弄第び步池尸豺のための办忍弄な数恕は、毋えばAusubel∈1995∷、p. 16-19×16≥25により淡很される。
≮0258≯
Ztnfr12はZtnfr12笆嘲のリガンドを冯圭することができる。Ztnfr12ポリペプチドはそのような纳裁の、材墙拉あるZtnfr12リガンドを票年し、そして帽违するために蝗脱される评る。毋えば、塑券汤のタンパク剂第びペプチドが、カラム惧に盖年され、そしてカラム惧で侯瓢する栏湿池弄サンプルからのリガンドを冯圭するために蝗脱され评る∈Hermansonなど. (eds.), Immobilized Affinity Ligand Techniques, P. 195-202 (Academic Press 1992)∷。
≮0259≯
减推挛リガンドとして、Ztnfr12ポリペプチドの宠拉が、减推挛冯圭第び鲁く栏妄池弄嘿甩炳批に簇息する、嘿甩嘲焕拉步庐刨唆はプロトン怯蒗を卢年する、肪燎に答づくバイオセンサ〖のマイクロフィジオメ〖タ〖により卢年され评る。诺房弄な刘弥は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより澜陇されるCytosensorTM マイクロフィジオメ〖タ〖である。硷」の嘿甩炳批、毋えば嘿甩笼浚、イオン廷流、エネルギ〖栏喇、标旧炳批、拇泪第び减推挛宠拉步第び票屯のものが、この数恕により卢年され评る。
≮0260≯
毋えば、McConnell, H.M.など., Science 257¨1906-1912, 1992; Pitchford, S. など., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997: Arimilli, S. など., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. など., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998を徊救のこと。さらに、マイクロフィジオメ〖タ〖は、烧缅拉唆は润烧缅拉靠乘唆は付乘嘿甩をアッセイするために蝗脱され评る。箕粗にわたっての嘿甩禽孟における嘿甩嘲焕拉步恃步を卢年することによって、マイクロフィジオメ〖タ〖は、硷」の簧枫に滦する嘿甩炳批、毋えばZtnfr12のアゴニスト、リガンド唆はアンタゴニストを木儡弄に卢年する。
≮0261≯
毋えば、マイクロフィジオメ〖タ〖は、Ztnfr12ポリペプチドを券附しない滦救の靠乘缴肩に孺秤して、Ztnfr12≥券附靠乘嘿甩の炳批を卢年するために蝗脱され评る。Ztnfr12≥拇泪簧枫に滦して炳批拉の努磊な嘿甩は、Ztnfr12券附バクタ〖を崔んで喇る寥垂え缴肩嘿甩、第び欧脸においてZtnfr12を券附する嘿甩を蜀崔する。嘿甩嘲焕拉步は、Ztnfr12≥拇泪された嘿甩炳批についての1つの卢年を捏丁する。さらに、このアプロ〖チは、Ztnfr12リガンド、そのアゴニスト第びアンタゴニストを票年するために蝗脱され评る。毋えば、尸灰は、Ztnfr12ポリペプチドを券附する嘿甩を丁惦し、涟淡嘿甩の妈1婶尸を、活赋步圭湿の稍哼布で禽蛙し、涟淡嘿甩の妈2婶尸を、活赋步圭湿の赂哼布で禽蛙し、そして涟淡妈1婶尸と孺秤して、涟淡妈2婶尸が嘿甩炳批を绩すかどうかを疯年することによって、Ztnfr12リガンドのアゴニストとして票年され评る。
≮0262≯
戮数では、盖陵システムが、Ztnfr12リガンド、ZTNF4のアゴニスト唆はアンタゴニストを票年するために蝗脱され评る。毋えば、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12突圭タンパク剂が、辉任のバイオセンサ〖刘弥の减推挛チップの山烫惧に盖年され评る∈BLACORE, Biacore AB; uppsala, Sweden∷。この刘弥の蝗脱は、毋えばkarlsson, Immunol. Methods 145:229 (1991)、第びCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993) により倡绩される。
≮0263≯
缄没には、Ztnfr12ポリペプチド唆は突圭タンパク剂は、萎瓢嘿甩柒の垛フィルムに冯圭されるデキストラン痢拜に、アミン唆はスルフヒドリル步池を脱いて、鼎铜冯圭される。肌ぎに、活赋サンプルが、嘿甩を奶して奶される。リガンドがサンプルに赂哼する眷圭、それは盖年されたポリペプチド唆は突圭タンパク剂に冯圭し、禽孟の二擂唯の恃步を苞き弹こし、これが垛フィルムの山烫プラスモン鼎棠の恃步として浮叫される。このシステムは、冯圭科下拉が纷换され评るオン≥第びオフ≥庐刨の卢年、第び冯圭の步池翁侠の删擦を材墙にする。このシステムはまた、钩挛≥钩付陵高侯脱、第び戮の输挛/钩≥输挛滦の陵高侯脱を活赋するためにも蝗脱され评る。
≮0264≯
Ztnfr12冯圭ドメインはさらに、Ztnfr12リガンドアゴニストの夸年惧の儡卡婶疤アミノ焕の仆脸恃佰に簇息して、乘姬丹鼎棠、冯窘池、排灰搀擂唆は各科下拉ラベリングのような祷恕により疯年されるように、固陇挛の湿妄弄尸老により泼魔づけられ评る。毋えば、de Vosなど., Science 255:306 (1992), Smithなど., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), 第びWlodaverなど., FEBS Lett. 309: 59 (1992) を徊救のこと。
≮0265≯
塑券汤はまたZtnfr12ポリペプチドがポリマ〖により息冯される、步池弄に饯峻されたZtnfr12寥喇湿を措茶する。毋绩弄なZtnfr12ポリペプチドは、怠墙弄なトランスメンブランドメインを风いている材拖拉ポリペプチド、毋えば芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69から喇るポリペプチド、唆は芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79から喇るポリペプチドである。诺房弄には、涟淡ポリマ〖は、Ztnfr12冯圭挛が垮拉茨董、毋えば栏妄池弄茨董において睦怕しないよう垮拖拉である。努磊なポリマ〖の毋は、帽办の瓤炳答、毋えばアシル步のための宠拉エステル、唆はアルキル步のためのアルデヒドを铜する饯峻されている1つのポリマ〖である。
≮0266≯
この眷圭、脚圭步の镍刨は拇泪され评る。瓤炳拉アルデヒドの毋は、ポリエチレングリコ〖ルプロピオンアルデヒド、唆はモノ≥∈C1≥C10∷アルコキシ、唆はそれらのアリ〖ルオキシ投瞥挛である∈毋えば、Harrisなど., アメリカ泼钓妈5,252,714规を徊救のこと∷。ポリマ〖は晦尸かれ嚎であっても、唆は晦尸かれ嚎でなくても紊い。さらに、ポリマ〖の寒圭湿がZtnfr12儡圭挛を栏喇するために蝗脱され评る。
≮0267≯
迹闻のために蝗脱され评るZtnfr12儡圭挛は、板挑弄に钓推できる垮拖拉ポリマ〖喇尸を崔むことができる。努磊な垮拖拉ポリマ〖は、ポリエチレングリコ〖ル∈PEG∷、モノメトキシ≥PEG、モノ≥∈C1≥C10∷アルコキシ≥PEG、アリ〖ルオキシ≥PEG、ポリ≥∈N≥ビニルピロリドン∷PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス≥スクシンイミジルカ〖ボネ〖トPEG、プロピレングリコ〖ルホモポリマ〖、焕步ポリプロピレン/焕步エチレンコポリマ〖、ポリオキシエチル步されたポリオ〖ル∈毋えば、グリセロ〖ル∷、ポリビニルアルコ〖ル、デキストラン、セルロ〖ス唆は戮の煤垮步湿答亨のポリマ〖を蜀崔する。努磊なPEGは、腆600×腆60,000、毋えば5,000、12,000第び25,000の尸灰翁を铜することができる。Ztnfr12儡圭挛はまた、そのような垮拖拉ポリマ〖の寒圭湿も崔むことができる。
≮0268≯
Ztnfr12儡圭挛の1つの毋は、Ztnfr12喇尸、第びZtnfr12喇尸のN≥琐眉に冯圭される焕步ポリアルキル喇尸を崔んで喇る。PEGは、1つの努磊な焕步ポリアルキルである。毋绩として、Ztnfr12は、PEG、すなわち∪PEG步∩として梦られている数恕により饯峻され评る。Ztnfr12のPEG步は、碰度肠において梦られているPEG步瓤炳のいずれかにより乖われ评る∈毋えば、ヨ〖ロッパ泼钓妈0154316规、Delgadoなど., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994) 第びFrancis など., Int, J. Hematol. 68: 1 (1998) を徊救のこと∷。
≮0269≯
毋えば、PEG步は瓤炳拉ポリエチレングリコ〖ル尸灰によるアシル步瓤炳唆はアルキル步瓤炳により乖われ评る。戮のアプロ〖チにおいては、Ztnfr12儡圭挛は、PEGの琐眉ヒドロキシ唆はアミノ答が宠拉步されたリンカ〖により弥垂されている宠拉步されたPEGを教圭することによって妨喇される∈毋えば、Karasiewiczなど., アメリカ泼钓妈5,382,657规を徊救のこと∷。
≮0270≯
アシル步によるPEG步は诺房弄には、Ztnfr12ポリペプチドとPEGの宠拉エステル投瞥挛との瓤炳を涩妥とする。宠拉步されたPEGエステルの毋は、N≥ヒドロキシスクシンイミドにエステル步されたPEGである。塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、脱胳∪アシル步∩とは、Ztnfr12と垮拖拉ポリマ〖粗のタイプの冯圭を蜀崔する¨アミド、カルバメ〖ト、ウレタン第び票屯のもの。アシル步によるPEG步されたZtnfr12の拇澜数恕は、诺房弄には、∈a∷Ztnfr12ポリペプチドとPEG∈毋えば、PEGのアルデヒド投瞥挛の瓤炳拉エステル∷とを、1唆は剩眶のPEG答がZtnfr12に冯圭する掘凤布で瓤炳せしめ、そして∈b∷その瓤炳栏喇湿を评る檬超を崔んで喇る。办忍弄に、アシル步瓤炳のための呵努な瓤炳掘凤は、贷梦のパラメ〖タ〖第び疥司する冯蔡に答づいて疯年されるであろう。毋えば、PEG¨Ztnfr12の孺が光いほど、ポリPEG步されたZtnfr12栏喇湿の◇が光くなる。
≮0271≯
アシル步によるPEG步の栏喇湿は诺房弄には、リシンε≥アミノ答がアシル冯圭を奶してPEG步されるポリPEG步されたZtnfr12栏喇湿である。诺房弄には、その评られるZtnfr12は、警なくとも95◇、モノ≥、ジ≥唆はトリ≥ペルギレ〖トされるが、芒し光い镍刨のPEG步を铜するいくつかの硷は、その瓤炳掘凤に巴赂して妨喇され评る。PEG步された硷は、筛洁の篮澜数恕、毋えば譬老、嘎嘲呱册、イオン蛤垂クロマトグラフィ〖、科下拉クロマトグラフィ〖第び票屯のものを脱いて、儡圭されていないZtnfr12ポリペプチドから尸违され评る。
≮0272≯
アルキル步によるPEG步は办忍弄に、丛傅恨の赂哼布で、Ztnfr12と、PEGの琐眉アルデヒド投瞥挛との瓤炳を蜀崔する。PEG答は攻ましくは、≥CH2≥NH答を奶してポリペプチドに冯圭される。
≮0273≯
モノPEG步された栏喇湿を栏喇するためへの丛傅拉アルキル步を奶しての投瞥挛步は、投瞥挛步のために网脱できる佰なったタイプの妈1アミノ答の绩汗瓤炳拉を网脱する。诺房弄には、涟淡瓤炳は、リシン荒答のε≥アミノ答とタンパク剂のN≥琐眉荒答のα≥アミノ答との粗のpKa汗佰の网脱を材墙にするpHで乖われる。そのような联买弄投瞥挛步により、瓤炳拉答、毋えばアルデヒドを崔む垮拖拉ポリマ〖のタンパク剂への冯圭が拇泪される。ポリマ〖との儡圭は、戮の瓤炳拉答、毋えばリシン娄嚎アミノ答の铜罢な饯峻を燃なわないで、タンパク剂のN≥琐眉で庭黎弄に栏じる。塑券汤は、Ztnfr12モノポリマ〖儡圭挛の悸剂弄な拇澜湿を捏丁する。
≮0274≯
モノポリマ〖Ztnfr12儡圭挛尸灰の悸剂弄に堆剂な礁媚を栏喇するための丛傅拉アルキル步は、∈a∷Ztnfr12のアミノ琐眉でのα≥アミノ答联买弄饯峻を材墙にするために努磊なpHでの丛傅拉アルキル步掘凤布で瓤炳拉PEGとンZtnfr12ポリペプチドとを瓤炳せしめ、そして∈b∷瓤炳栏喇湿を评る檬超を崔んで喇る。丛傅拉アルキル步のために蝗脱される丛傅恨は、垮拖闭において奥年拉であり、そして攻ましくは、丛傅拉アルキル步の介袋供镍において妨喇されるSchiff宾答のみを丛傅できるべきである。攻ましくは丛傅恨は、怙垮燎步ナトリウム、シアノ怙垮燎步ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン第びビリジンボランを蜀崔する。
≮0275≯
モノポリマ〖Ztnfr12儡圭挛の悸剂弄に堆剂な礁媚に簇しては、丛傅拉アルキル步瓤炳掘凤は、Ztnfr12のN≥琐眉への垮拖拉ポリマ〖の喇尸の冯圭を材墙にするそれらの掘凤である。そのような瓤炳掘凤に、N≥琐眉でのα≥アミノ答とリシンアミノ答との粗のpKa汗佰を捏丁する。pHはまた、蝗脱されるポリマ〖¨タンパク剂の孺にも逼读を第ぼす。办忍弄に、pHが你い眷圭、タンパク剂よりも册娟翁のポリマ〖が、N≥琐眉α≥答が瓤炳拉であるほど、より驴くのポリマ〖が呵努な掘凤を茫喇するために、涩妥とされるので、疥司される。pHが光い眷圭、ポリマ〖¨Ztnfr12は、より驴くの瓤炳拉答が网脱できるので、光くある涩妥はない。诺房弄には、pHは、3×9唆は3×6の认跋柒であろう。
≮0276≯
雇胃すべきもう1つの傍灰は、垮拖拉ポリマ〖の尸灰翁である。办忍弄に、ポリマ〖の尸灰翁が光いほど、より警眶のポリマ〖尸灰がタンパク剂に冯圭され评る。PEG步瓤炳に簇しては、诺房弄な尸翁は、腆2kDa×腆100kDa、腆5kDa×腆50kDa唆は腆12kDa×腆25kDaである。垮拖拉ポリマ〖¨Ztnfr12のモル孺は、办忍弄に、1¨1×100¨1の认跋であろう。诺房弄には、垮拖拉ポリマ〖¨Ztnfr12のモル孺は、ポリPEG步に簇して、1¨1×20¨1であり、そしてモノPEG步に簇しては、1¨1×5¨1であろう。
≮0277≯
ポリペプチド第び垮拖拉ポリマ〖喇尸を崔んで喇る儡圭挛を栏喇するための办忍弄な数恕は碰度肠において梦られている。毋えば、Karasiewiczなど., アメリカ泼钓妈5,382,657规、Greewaldなど., アメリカ泼钓妈5,738,846规、Nieforthなど., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh など., Anal. Biochem. 247: 434 (1997) を徊救のこと。
≮0278≯
塑券汤は、塑汤嘿今に淡很されるペプチド唆はポリペプチドを崔んで喇る寥喇湿を措茶する。そのような寥喇湿はさらに、キャリヤ〖を崔むことができる。涟淡キャリヤ〖は、骄丸の铜怠唆は痰怠キャリヤ〖であり评る。キャリヤ〖の毋は、垮、此咀闭、アルコ〖ル、ポリエチレングリコ〖ル、マクロゲル、ゴマ听、トウモロコシ听第び票屯のものを蜀崔する。
≮0279≯
さらに、寥喇湿は、キャリヤ〖、Ztnfr12ポリペプチド、第びTACIポリペプチド唆はBCMAポリペプチドの1つを崔んで喇ることができる。办年の寥喇湿は、それらの减推挛の材拖拉妨を崔んで喇る。そのような寥喇湿の毋は、キャリヤ〖、芹误戎规2のアミノ焕荒答7≥69∈毋えば、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79, 1≥69, 1≥79, 1≥71唆は7≥71から喇るポリペプチドを崔んで喇るZtnfr12ポリペプチド、第び∈1∷芹误戎规7のアミノ焕荒答1≥51を崔んで喇るBCMAポリペプチド、∈2∷芹误戎规8のアミノ焕荒答1≥166を崔んで喇るTACIポリペプチド唆は∈3∷芹误戎规7のアミノ焕荒答1≥51を崔んで喇るBCMAポリペプチド、第び芹误戎规8のアミノ焕荒答1≥166を崔んで喇るTACIポリペプチドを崔んで喇る寥喇湿を蜀崔する。
≮0280≯
7ˉZtnfr12ポリペプチド第び突圭タンパク剂についてのアッセイ
Ztnfr12ポリペプチド第びZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂の怠墙が、ZTNF4を突圭する突圭タンパク剂の墙蜗を删擦するために硷」のアプロ〖チを脱いて活赋され评る。毋えば、1つのアプロ〖チは、125I≥ラベルされたZTNF4の冯圭についてZtnfr12≥蕊胜されたプレ〖トと顶凌するZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂の墙蜗を卢年する。毋绩のように、50μgのZTNF4が、帽办IODO≥BEAD∈Pierce〃Rockford, IL∷を脱いて、4mCiの125Iによりラベルされ评る。その瓤炳がウシ缝蓝アルブミンの0.25◇拖闭により缔武され、そして头违125IがPD≥10カラム∈Pierce∷を脱いてのゲル呱册により近殿される。
≮0281≯
125I≥ZTNF4拇澜湿の孺庶纪墙が、忙宾檬超の涟第び稿、トリクロロ枯焕睦怕により疯年される。∪Ztnfr12≥N∩として炭叹された、Ztnfr12减推挛のN≥琐眉フラグメントが、96≥ウェルプレ〖トに藕裁され∈毋えば、0.1μg/mlで100μl∷、そして4☆で办日インキュベ〖トされる。プレ〖トが丽爵され、SUPERBLOCK∈Pierce∷によりブロックされ、そして浩び丽爵される。0×腆12ng/mlの认跋の硷」の腔刨でのZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥Fc菇喇挛が、盖年された腔刨の125I≥ZTNF4と鼎に寒圭され、そしてZtnfr12≥Nにより蕊胜されたプレ〖ト惧で37☆で腆2箕粗インキュベ〖トされる。滦救は、拖闭でのZtnfr12を崔むか、唆はZtnf12ポリペプチド唆はZtnfr12≥Fc菇喇挛を风いている。インキュベ〖ションの稿、プレ〖トは丽爵され、そして纷眶される。
≮0282≯
もう1つのアプロ〖チにおいては、惧竞する腔刨の125IラベルされたZTNF4が、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥Fc菇喇挛と鼎にインキュベ〖トされ、そして睦怕されたZTNF4≥Ztnfr12ポリペプチド剩圭挛唆はZTNF4≥Ztnfr12≥Fc剩圭挛に簇息する庶纪墙が卢年される。毋绩のように、腆0.05nMのZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥Fc菇喇挛が、腆0.4pM×腆1.5nMの125I≥ZTNF4と鼎に、瓷碰たり0.25mlの圭纷挛姥で、30尸粗、技补でインキュベ〖トされ评る。
≮0283≯
Pansorbin (Staph A) 伏蛮闭が改」の瓷に藕裁され、そして15尸稿、サンプルが斌看尸违され、2刨丽爵され、そしてペレットが纷眶される。润泼佰弄冯圭が、125I≥ZTNF4/Ztnfr12ポリペプチドミックス、唆は125I≥ZTNF4/Ztnfr12≥Fcミックスへの130nMのラベルされていないZTNF4の藕裁により疯年される。泼佰弄冯圭が、改」の腔刨の125I≥ZTNF4で冯圭される圭纷cpmからラベルされていないZTNF4の赂哼布で冯圭されたcpmを沟近することによって纷换される。
≮0284≯
戮数では、Ztnfr12ポリペプチド第びZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂が、Grossなど., 柜狠给倡戎规WO 00/40716规により淡很のようにして、材拖拉ZTNF4によるヒトB嘿甩の簧枫を了巢する墙蜗により泼魔づけられ评る。缄没には、ヒトB嘿甩が、CD19姬丹ビ〖ズ第びVarioMacs姬丹尸违システム∈Miltenyi Biotec; Auburn, CA∷を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、琐究缝闭帽乘嘿甩から帽违される。篮澜されたB嘿甩は、材拖拉ZTNF4∈25ng/ml∷第び寥垂えヒトIL≥4∈10ng/ml, Pharmingen∷と鼎に寒圭され、そして嘿甩がウェル碰たり1∵105改の嘿甩で摧撵96ウェルプレ〖ト惧にプレ〖トされる。
≮0285≯
Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリンタンパク剂が腆5μg/ml×腆6ng/mlに歹坚され、そしてウェル碰たり1μCiの3H≥チミジンにより4泣誊、办日パルスしながら、B嘿甩と鼎に5泣粗インキュベ〖トされる。滦救として、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリンタンパク剂がまた、ATNF4を燃なわないで、B嘿甩第びIL≥4と鼎にインキュベ〖トされ评る。プレ〖トが、Packardプレ〖ト箭诚怠を脱いて箭诚され、そしてPackardリ〖ダ〖を脱いて纷换される。
≮0286≯
浇尸に澄惟された瓢湿モデルが、办年の祭陕觉轮におけるZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリンタンパク剂のインビボ跟墙を活赋するために掐缄できる。毋えば、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリンタンパク剂は、驴くの极甘倘敝祭吹の瓢湿モデル、毋えばSLE∈链咳拉エリテマト〖デス∷のモデルとして侯脱するMRL≥lpr/lpr唆はNZB∵NZW F1コンジェニックマウス臭において活赋され评る。そのような瓢湿は、碰度肠において梦られている∈毋えば、Cohen and Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc., 1994を徊救のこと)。
≮0287≯
New Zealand Black (NZB) マウスとNew Zealand White (NZW) マウスとの粗の蛤花の灰鹿が、ヒトにおけるSLEに泰儡に梧击するSLEの极券妨を喇墓せしめる。NZBWとして梦られているそれらの灰鹿マウスは、栏稿1ヶ奉でT≥嘿甩に滦してIgM极甘钩挛を喇墓し幌め、そして栏稿5×7ヶ奉までに、钩≥DNA极甘钩挛は庭拉倘敝グロブリンである。ポリクロ〖ナルB≥嘿甩册宠拉は、极甘钩挛の册栏喇を瞥く。それらの极甘钩挛、泼に办塑嚎のDNAに滦して羹けられたそれらの钩挛の睦缅は、タンパク洽、免燎缝旧第び空稍链からの秽舜として巫静池弄に汤球である诲靛挛空标の渴乖に簇息している。
≮0288≯
空稍链は、极券拉SLEにより逼读されるマウスにおいて秽の拣徵付傍であり、そしてNZBW臭においては、この供镍は她拉第び誓荷拉である。涟淡祭陕は秃よりも惑においてより缔庐愁つ脚旧であり、そして士堆栏赂泣は秃の406泣に孺秤して、惑はわずか245泣である。惑マウスの驴くは、栏稿7×9ヶ奉まで旧铬拉∈タンパク洽拉∷であるが、それらの部嗓かは、それらが魔铬を渴乖する眷圭、より笺いか唆は钳をとっている。NZBWマウスに斧られる米炭弄な空标は、ヒトSLEにおいて斧られる诲靛挛空标に润撅に梧击し、この极券弄ネズミモデルを、材墙拉あるSLE迹闻の活赋のために润撅に胎蜗弄にする∈Putterman and Naparstek, ∪Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus∩, in Autoimmune Disease Models: A Guidebook, Pages 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan など., J. Immunol. 154: 1470 (1995); 第びDaikhなど., J. Immunol. 159: 3104 (1997)∷。
≮0289≯
Grossなど., 柜狠给倡戎规WO 00/40716规により淡很されるように、ZTNF4を冯圭するTACI≥倘敝グロブリンタンパク剂が、士堆して、B≥嘿甩极甘钩挛栏喇がNZBWマウスにおいて光いレベルで赂哼すると蛔われる眷圭、5降粗にわたってB嘿甩に滦するその娃扩跟蔡をモニタ〖するためにNZBWマウスに抨涂され评る。この数恕は、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂のZtnfr12ポリペプチドの跟墙を疯年するために努脱され评る。缄没には、100嗓の栏稿8降誊の惑∈NEB∵NZW∷F1マウスが、15嗓のマウスの6硷のグル〖プに尸けられ评る。
≮0290≯
借妄の涟、マウスはタンパク洽について1ヶ奉に1刨モニタ〖され、そして缝闭がCBC第び缝蓝バンクのために何缝される。タンパク洽は诲靛挛空标の诺房弄な魔铬であるので、洽タンパクレベルが、甫垫の袋粗にわたって、惮搂弄な粗持で纷翁死によりモニタ〖される。借妄は、マウスが栏稿、腆5ヶ奉である眷圭に倡幌される。マウスは、ビ〖クルのみ∈リン焕此咀闭∷唆はヒト倘敝グロブリン∈滦救タンパク剂∷、唆はZtnfr12≥倘敝グロブリンタンパク剂∈毋えば、脱翁碰たり20×100μgの活赋タンパク剂∷を、5降粗、3刨减ける。梧击する甫垫がZtnfr12にポリペプチドにより乖われ评る。
≮0291≯
缝闭は、借妄の粗、2刨、何缝され、そして借妄の稿、警なくとも2刨、何缝されるであろう。タンパク洽においての洽纷翁死猛第び挛脚が、借妄の倡幌の稿、2降ごとに卢年される。缝闭、洽纷翁死猛第び挛脚が、奥弛秽の箕爬で艰られる。纾隆第び痘粒が、分各宠拉步された嘿甩尸梧尸老第び寥骏池のために尸けられる。布耻布旅闭粒、牟粗遂リンパ泪嚎、次隆驼第び美枪、陶牟第び络牟、斑、井牟、绻隆、宝空隆、甥空、厘∈第び丹瓷第び咯苹∷、看隆第び琴がまた、寥骏甫垫のために箭礁される。
≮0292≯
悸赋脱アレルギ〖拉蔷涝狂标についてのネズミモデルが、倘敝拆哼拉祭陕の怠菇、第び材墙拉ある迹闻拆掐数恕の尉荚を拇べるための缄檬として蝗脱されて丸た。このモデルはヒト驴券拉古步旧に梧击し、そして坷沸タンパク剂、毋えばミエリン答塑タンパク剂唆はタンパク婚剂タンパク剂へのT≥嘿甩宠拉步の冯蔡として忙狂を栏喇する。钩付による儡硷は、CD4+、クラスII MHC≥扩嘎されたT≥嘿甩∈Th1∷の投券を瞥く。悸赋脱アレルギ〖拉蔷涝狂标についてのプロトコ〖ルの恃步は、モデルの缔拉、她拉≥浩券拉唆は减瓢拉≥トランスファ〖恃佰挛を栏喇することができる∈Weinbergなど., J. Immunol. 162: 1818 (1999);Mijabaなど., Cell. Immunol. 186:94 (1999); 第びGlabinski, Meth. Enzym. 288: 182 (1997)∷。
≮0293≯
Grossなど., 柜狠给倡戎规WO 00/40716规は、悸赋のアレルギ〖拉蔷涝狂标に簇息する魔铬の猖帘におけるTACI≥倘敝グロブリンタンパク剂の跟墙の删擦への1つのアプロ〖チを淡很する。缄没には、25嗓の惑PLxSJL F1マウス∈栏稿12降∷は、窗链フロイントアジュバントに芹圭された钩付∈エミリンタンパク剂、PLP, 荒答139≥151∷を125μg/マウスで乳布庙纪される。マウスは、5嗓のマウスの5硷のグル〖プに尸けられる。纱泣潮魄燎∈400ng∷の盛剐柒庙纪が、0第び2泣誊に涂えられる。グル〖プは、1擒、10擒唆は100擒脱翁のTACI≥倘敝グロブリンタンパク剂を涂えられ、1つのグル〖プはビ〖クルのみを减け、そして1つのグル〖プは借妄を减けないであろう。徒松闻恕は、0泣誊に倡幌し、拆掐闻恕は7泣誊に、唆は巫静池弄魔铬の倡幌で幌まる。
≮0294≯
祭陕の魔铬、挛脚の你布第び算徙が腆10×14泣で汤球であり、そして腆1降粗、鲁く。瓢湿は、挛脚を纷翁し、そしてそれらの魔铬の镍刨に滦炳する巫静池弄删爬を充り碰てることによって髓泣、删擦される。悸赋のアレルギ〖拉蔷涝狂标の巫静池弄魔铬は、儡硷の10×14泣笆柒に附れ、そして腆1降粗、鲁く。甫垫の呵稿で、すべての瓢湿は、ガスの册娟抨涂により奥弛秽され、そして浮秽される。蔷第び涝那が寥骏甫垫のために箭礁され、唆はmRNA尸老のために培冯される。挛脚第び巫静池弄删爬のデ〖タが改客第びグル〖プによりプロットされる。このアプロ〖チは、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂を活赋するために蝗脱され评る。
≮0295≯
コラ〖ゲン≥投券された簇泪标モデルにおいては、マウスは、ヒトリウマチ屯簇泪标に泰儡に梧击する她拉标旧拉簇泪标を渴乖する。コラ〖ゲン≥投券された簇泪标はリウマチ屯簇泪标と、倘敝池弄第び陕妄池弄泼魔を鼎铜するので、これは、材拖拉あるヒト钩标旧拉步圭湿をスクリ〖ニングするための妄鳞弄モデルにする。コラ〖ゲン≥投券された簇泪标モデルを脱いることのもう1つの网爬は、陕傍の怠菇が梦られていることである。
≮0296≯
II房コラ〖ゲン惧のT第びB嘿甩エピト〖プは票年されており、そして倘敝≥拆哼拉簇泪标に簇息する、硷」の倘敝池弄∈觅变された房の册髓拉第び钩≥コラ〖ゲン钩挛∷第び标旧拉∈サイトカイン、ケモカイン第びマトリックス≥尸豺拉冠燎∷パラメ〖タ〖は疯年されており、そしてモデルにおける活赋步圭湿跟墙を删擦するために蝗脱され评る∈Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407∈1999∷〃Williamsなど., Immunol. 89: 9784 (1992); Myersなど., Life Sci. 61: 1861 (1997); 第びWangなど., Immunol. 92: 8955 (1995)∷。
≮0297≯
Grossなど., 柜狠给倡戎规WO 00/40716规は、コラ〖ゲン≥投券された簇泪标に簇息する魔铬の猖帘におけるTACI≥倘敝グロブリンタンパク剂の跟墙を删擦するための数恕を淡很する。缄没には、栏稿8降の秃のDBA/1Jマウス∈Jackson Labs∷が、5嗓のマウス/グル〖プのグル〖プに尸けられ、そして3降粗突で、1mg/mlのコラ〖ゲン∈ニワトリ唆はウシ弹富∷50×100μlの2搀の乳布庙纪を涂えられる。1つの滦救は、コラ〖ゲン庙纪を减けない。妈1搀誊の庙纪は、窗链フロイントアジュバントにおいて芹圭され、そして妈2搀誊の庙纪は、稍窗链フロイトアジュバントにおいて芹圭される。
≮0298≯
TACI≥倘敝グロブリンタンパク剂が、2搀誊の庙纪の箕爬で唆はその涟、唆は瓢湿が警なくとも24箕粗、积鲁する、2唆はそれ笆惧の巫静池弄删爬を渴乖した稿、徒松弄に抨涂される。瓢湿は、奶撅2×3降笆柒に、妈2搀誊のコラ〖ゲン庙纪に鲁いて、簇泪标の旧觉を绩し幌める。毋えば、TACI≥Fc、滦救タンパク剂、ヒトIgFc唆はリン焕此咀拖闭∈ビ〖クル∷が、妈2搀誊の庙纪の7泣涟∈≥7泣誊∷、徒松弄に抨涂され评る。タンパク剂は、100μlの盛剐柒庙纪として降3刨、涂えられ、そして4降粗、鲁けられる。
≮0299≯
祭陕の镍刨が、颅の更さを卢年するためにカリパスを脱い、そして改」の颅に巫静池弄删爬を充り碰てることにより改」の颅において删擦される。毋えば、∪0∩の巫静池弄删爬は赖撅なマウスを绩し、∪1∩の删爬は、1唆は剩眶の颅回が乐くはれ惧がることを绩し、∪3∩の删爬は、面疤の颅の标旧を绩し、そして∪4∩の删爬は脚刨の颅の标旧を绩す。瓢湿は、祭陕が肋年袋粗、奶撅7泣粗、澄惟された稿、奥弛秽される。颅が寥骏甫垫唆はmRNA尸老のために礁められ、そして缝蓝が倘敝グロブリン第びサイトカインアッセイのために箭礁される。コラ〖ゲン≥投券された簇泪标モデルは、Ztnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12倘敝グロブリン突圭タンパク剂を活赋するために蝗脱され评る。
≮0300≯
脚旧囤痰蜗旧は、ネズミモデルが网脱できるもう1つの极甘倘敝祭吹である。脚旧囤痰蜗旧は、ニコチン屯アセチルコリン减推挛に滦して羹けられた极甘钩挛の栏喇を蜀崔する、坷沸囤迄帕茫の俱巢である。この祭陕は、笨瓢に滦する佰撅な吊煎第び辱汐を蜀崔する巫静池弄泼魔を惩评するか、唆は减け费がれる。
≮0301≯
脚旧囤痰蜗旧のネズミモデルは澄惟されている∈Christadossなど., ∪Establishment of a Mouse Model of Myaschenia gravis Which Mimics Human Myashenia gravid Phathogenesis for Immune Intervention∩, in Immunology of Proteins and Peptide VIII, Atassi and Bixler (Eds.), Pages 195-199 (1995)∷。悸赋の极甘倘敝脚旧囤痰蜗旧は、アセチルコリン减推挛に滦する钩挛の赂哼により泼魔づけられる钩挛拆哼拉祭陕である。それらの钩挛は、囤迄の吊煎さをもたらす、风促拉坷沸囤迄排丹弄咀封を瞥く减推挛を撬蝉する。
≮0302≯
悸赋の极甘倘敝脚旧囤痰蜗旧モデルにおいては、マウスがニコチン屯アセチルコリン减推挛により倘敝步される。脚烬囤迄痰蜗旧の巫静池弄魔铬は、企肌倘敝步の稿、眶降で汤らかになる。悸赋の极甘倘敝脚旧囤痰蜗旧は、ラジオイムノアッセイによるアセチルコリン减推挛钩挛の缝蓝レベルの卢年∈Christadoss and Dauphinee, J. Immunol. 136: 2437 (1986); Liadstromなど., Methods Enzymol. 74: 432 (1981)∷、囤迄アセチルコリン减推挛の卢年を蜀崔するいくつかの数恕、唆は囤排哭浮汉∈Coligan など. (Ed.), protocols in Immunolog. Vol. 3, page15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)∷により删擦される。
≮0303≯
悸赋の极甘倘敝脚旧囤痰蜗旧に滦するZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂の跟蔡は、B6マウスにおける巫静池弄脚旧囤痰蜗旧の渴乖の粗、突圭タンパク剂を抨涂することによって疯年され评る。毋えば、100嗓のB6マウスが、0第び30泣誊、窗链フロイントアジュバント面、20μgのアセチルコリン减推挛により倘敝步される。腆40×60◇マウスが、アセチルコリン减推挛による纳裁倘敝步の稿、面疤∈霹甸2∷×脚刨∈霹甸3∷の巫静池弄脚旧囤痰蜗旧を渴乖するであろう。
≮0304≯
霹甸2第び3の巫静池弄祭陕を铜するマウスが、3硷のグル〖プ∈霹しい霹甸の吊煎拉を铜する∷に尸けられ、そして纷翁され∈吊煎拉を铜するマウスはまた、それらが咯湿第び垮の久锐において氦岂拉を铜するので、挛脚が你布する∷、そして缝蓝∈涟借妄钩≥アセチルコリン减推挛钩挛第びイソタイプレベルについて∷のために庶缝される。グル〖プAは、リン焕此咀拖闭によりI.P.庙纪され、グル〖プBは滦救タンパク剂∈100μg∷としてヒトIgG≥Feにより盛剐柒に庙纪され、そしてグル〖プCは100μgのZtnfr12ポリペプチド唆はZtnr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂により4降粗、降3刨、庙纪される。
≮0305≯
マウスは、降2刨、巫静池弄囤迄吊煎拉についてスクリ〖ンされ、そして纷翁され、そして借妄の倡幌の15第び30泣稿、缝蓝のために庶缝される。窗链な缝闭が、マ〖カ〖B220第びCD5を脱いて、分各宠拉步された嘿甩尸梧尸老によりT/B嘿甩孺を疯年するために、15泣誊に何缝される。栏赂するマウスは、借妄の倡幌の30×45泣稿に沪巢され、そしてそれらの秽挛は、囤迄アセチルコロン减推挛の禄己、すなわち脚旧囤痰蜗旧における拣徵陕妄池を疯年するために、囤迄アセチルコロン减推挛の稿での藐叫のために培冯される∈毋えば、Coliganなど: (Eds.), Protocols in Immunology. Vol.3, page 15. 8. 1 (John Wiley & Sons, 1997) を徊救のこと∷。
≮0306≯
マウス囤迄アセチルコリン减推挛に滦する缝蓝钩挛が、澄惟されたラジオイムノアッセイにより疯年され、そして钩≥アセチルコリン减推挛钩挛イソタイプ∈IgM, IgG1, IgG2b第びIgG2c∷がELISAにより卢年される。そのような数恕は梦られている。渴乖拉巫静池弄脚旧囤痰蜗旧、钩≥アセチルコリン减推挛钩挛第びイソタイプレベル、第び囤迄アセチルコロン减推挛禄烬に滦するZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂の跟蔡が疯年される。
≮0307≯
腆100嗓マウスが、0泣第び30泣誊、窗链フロイントアジュバント面、20μgのアセチルコリン减推挛により倘敝步され评る。巫静池弄脚旧囤痰蜗旧を铜するマウスは4硷のグル〖プに尸けられる。グル〖プは、100μgの滦救Fcにより盛剐柒庙纪され、グル〖プBは20μgの滦救Fcにより庙纪され、グル〖プCは100μgのZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12唆はZtnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂により庙纪され、そしてグル〖プDは20μgのZtnfr12ポリペプチド唆はZtnfr12≥倘敝ブリン突圭タンパク剂により4降粗、降3刨、庙纪される。マウスが纷翁され、そして借妄の倡幌の涟、第び15第び30泣で、缝蓝のために庶缝される。缝蓝は、惧淡のようにして、钩≥アセチルコリン减推挛第びイソタイプについて活赋される。囤迄アセチルコリン减推挛禄己がまた、卢年される。
≮0308≯
それらのインビトロ第びインビボアッセイがまた、Ztnfr12钩挛喇尸、钩挛突圭タンパク剂、倘敝儡圭挛第び票屯のものを删擦するために蝗脱され评る。Ztnfr12ポリペプチド、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂唆はZtnfr12钩挛喇尸の戮の努磊なアッセイは、碰度荚により疯年され评る。
≮0309≯
8ˉZtnfr12ポリペプチドの帽违
塑券汤のポリペプチドは、兵厉拉光尸灰、泼に戮のタンパク剂第び乘焕に滦して、警なくとも腆80◇の姐刨、警なくとも腆90◇の姐刨、警なくとも腆95◇の姐刨、唆は95◇笆惧の姐刨に篮澜することが攻ましく、そして炊厉拉第び券钱拉恨を铜さない。塑券汤のポリペプチドはまた、99.9◇笆惧の姐刨である板挑弄に姐胯な觉轮に篮澜され评る。泼年の澜恨においては、篮澜されたポリペプチドは、戮のポリペプチド、泼に瓢湿弹富の戮のポリペプチドを悸剂弄に铜さない。
≮0310≯
尸侍第び/唆は骄丸の篮澜数恕は、欧脸富∈毋えば、リンパ泪寥骏∷から篮澜されたZtnfr12、圭喇Ztnfr12ポリペプチド、第び寥垂え缴肩嘿甩から篮澜された寥垂えZtnfr12ポリペプチド第び突圭Ztnfr12ポリペプチドの拇澜湿を评るために蝗脱され评る。办忍弄に、尾焕アンモニウム睦怕第び焕唆はカオトロピック恨藐叫は、サンプルの尸侍のために蝗脱される。诺房弄な篮澜檬超は、ヒドロキシアパタイト、サイズ怯近、FPLC第び嫡陵光拉墙闭挛クロマトグラフィ〖を蜀崔する。努磊なクロマトグラフィ〖脱寝挛は、投瞥挛步されたデキストラン、アガロ〖ス、セルロ〖ス、ポリアクリルアミド、泼侍なシリカ第び票屯のものを蜀崔する。PEI、DEAE、QAE第びQ投瞥挛が攻ましい。
≮0311≯
诺房弄なクロマトグラフィ〖脱寝挛は、フェニル、ブチル唆はオクチル答により投瞥挛步されたもの、毋えばフェニル≥Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650∈Toso Haas, Montgomeryville, PA∷、オクチル≥Sepharrose (Pharmacia)第び票屯のもの〃唆はポリアクリル践婚、毋えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)第び票屯のものを蜀崔する。努磊な盖挛毁积挛は、ガラスビ〖ズ、シリカ答亨の践婚、セルロ〖ス践婚、アガロ〖スビ〖ズ、餐抖されたアガロ〖スビ〖ズ、ポリスチレンビ〖ズ、餐抖されたポリアクリルアミド践婚第びそれらが蝗脱される掘凤布で稍拖拉である票屯のものを蜀崔する。それらの毁积挛は、アミノ答、カルボキシル答、スルフヒドリル答、ヒドロキシル答第び】唆は煤垮步湿喇尸によるタンパク剂の冯圭を材墙にする瓤炳拉答より恃拉され评る。
≮0312≯
カップリング步池湿剂の毋は、江步シアン宠拉步、N≥ヒドロキシスクシンイミド宠拉步、エポキシド宠拉步、スルフヒドリル宠拉步、ヒドラジド宠拉步第びカルボジイミド カップリング步池湿剂のためのカルボキシル第びアミノ投瞥挛を蜀崔する。それらの第び戮の盖挛寝挛は碰度肠において紊く梦られており、そして弓く蝗脱されており、そして睛度弄丁惦荚から掐缄できる。ポリペプチド帽违第び篮澜の泼年数恕の联买は、奶撅のことであり、そして联买された毁积挛の拉剂により办婶疯年される。毋えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988、第びDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を徊救のこと。
≮0313≯
Ztnfr12帽违第び篮澜における纳裁の恃瓢は、碰度荚により拇泪され评る。毋えば、布淡のようにして评られる钩≥Ztnfr12钩挛は、倘敝科下拉篮澜により驴翁のタンパク剂を帽违するために蝗脱され评る。
≮0314≯
塑券汤のポリペプチドは、アニオン第びカチオン蛤垂クロマトグラフィ〖、サイズ怯近、第び科下拉クロマトグラフィ〖を蜀崔する数恕の寥み圭わせより帽违され评る。毋えば、盖年された垛掳イオン帝缅∈IMAC∷クロマトグラフィ〖が、ヒスチジンに少んでいるタンパク剂、第びポリヒスチジン筛急を崔んでなるそれらのタンパク剂を篮澜するために蝗脱され评る。缄没に咐第すれば、ゲルがまず、企擦垛掳イオンにより操排され、キレ〖トが妨喇される( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1≥7, 1985)。
≮0315≯
ヒスチジンに少んでいるタンパク剂が、蝗脱される垛掳イオンに巴赂して、佰なった科下拉を铜するこのマトリックスに帝缅され、そして顶凌拖叫、pHの你布、唆は动いキレ〖ト步恨の蝗脱により拖叫されるであろう。戮の篮澜数恕は、レクチン科下拉クロマトグラフィ〖第びイオン蛤垂クロマトグラフィ〖によるグリコシル步されたタンパク剂の篮澜を蜀崔する∈M. Deutscher, (ed.), Methods Enzymol. 182, 529(1990)∷。塑券汤のさらなる轮屯においては、督蹋あるポリペプチド、第び科下拉筛急∈毋えばマルト〖ス≥冯圭タンパク剂、FLAG筛急、Glu-Gku筛急、倘敝グロブリンドメイン∷の突圭挛が、篮澜を楼渴するために菇喇され评る。
≮0316≯
Ztnfr12ポリペプチド唆はそのフラグメントはまた、布淡のようにして、步池圭喇を奶して拇澜され评る。Ztnfr12ポリペプチドは、モノマ〖唆はマルチマ〖であり评〃グリコシル步されても、唆はグリコシル步されなくても紊く〃PEG步されても、唆はPEG步されなくても紊く〃そして介袋メチオニンアミノ焕荒答を崔むことができるか、唆は崔まなくても紊い。
≮0317≯
9ˉZtnfr12タンパク剂に滦する钩挛の栏喇
Ztnfr12に滦する钩挛は、毋えば钩付として、Ztnfr12券附ベクタ〖の栏喇湿唆は欧脸富から帽违されたZtnfr12を脱いて评られる。泼に铜脱な钩≥Ztnfr12钩挛は、Ztnfr12を、∪泼佰弄に冯圭する∩。钩挛は、その钩挛が肌の2つの拉剂の警なくとも1つを绩す眷圭、泼佰弄に冯圭すると蛔われる¨∈1∷钩挛が嘎肠レベルの冯圭宠拉を燃って、Ztnfr12に冯圭し、そして∈2∷钩挛がZtnfr12に簇息するポリペプチドと铜罢に蛤汗瓤炳しない眷圭。
≮0318≯
妈1の泼魔に簇しては、钩挛は、それらが、106M-1唆はそれ笆惧、攻ましくは107M-1唆はそれ笆惧、より攻ましくは108M-1唆はそれ笆惧、第び呵も攻ましくは109M-1唆はそれ笆惧の冯圭科下拉∈Ka∷を燃なって、Ztnfr12ポリペプチド、ペプチド唆はエピト〖プに冯圭する眷圭、泼佰弄に冯圭する。钩挛の冯圭科下拉は、Scatchard 尸老∈Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)∷により、碰度荚により推白に疯年され评る。妈2の泼魔に簇しては、钩挛は、それらが、筛洁のウェスタ〖ンブロット尸老を脱いて、Ztnfr12を浮叫するが、しかし附哼梦られているポリペプチドを浮叫しない眷圭、簇息するポリペプチドと铜罢に蛤汗瓤炳しない。贷梦の簇息するポリペプチドの毋は、贷梦の拣徵蝉秽傍灰减推挛を蜀崔する。毋えば、办年の钩≥Ztnfr12钩挛は、Ztnfr12と冯圭するが、しかしTACI唆はBCMAとは冯圭しない。
≮0319≯
钩≥Ztnfr12钩挛は、钩付拉Ztnfr12エピト〖プ≥么积ペプチドを脱いて栏喇され评る。塑券汤の钩付拉エピト〖プ≥么积ペプチド第びポリペプチドは、芹误戎规2柒に崔まれる、警なくとも9改、唆は15×腆30改のアミノ焕の芹误、唆は塑汤嘿今に倡绩されるもう1つのアミノ焕芹误を崔む。しかしながら、30×50改のアミノ焕、唆は塑券汤のポリペプチドの链アミノ焕芹误までのいずれかの墓さのアミノ焕を崔む、塑券汤のアミノ焕芹误の络きな婶尸を崔んで喇るペプチド唆はポリペプチドはまた、Ztnfr12と冯圭する钩挛を投券するためにも铜脱である。疥司には、エピト〖プ么积ペプチドのアミノ焕芹误は、垮拉拖寝において悸剂弄な拖豺拉を捏丁するよう联买される∈すなわち、涟淡芹误は、孺秤弄科垮拉の荒答を蜀崔し、そして谅垮拉荒答は攻ましくは、搀闰される∷。さらに、プロリン荒答を崔むアミノ焕芹误がまた、钩挛栏喇のために疥司される。
≮0320≯
毋绩のように、Ztnfr12における材墙拉ある钩付拉婶疤が、LASERGENE∈DNASTAR〃Madison, WI∷のPROTEANプログラム∈バ〖ジョン3.14∷により悸跟されるように、Jameson-Wolf method, Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181, (1988) を脱いて、票年された。デフォ〖ルトパラメ〖タ〖∈default parameter∷が、この尸老に蝗脱された。
≮0321≯
Jameson≥Wolf数恕は、タンパク剂菇陇徒卢のために6硷の肩妥サブル〖チンを寥圭すことによって、材墙拉ある钩付疯年答を徒卢する。缄没には、Hopp≥Woods数恕、Hoppなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3924 (1981) が呵介に、呵络の渡婶科垮拉の挝拌を山すアミノ焕芹误を票年するために蝗脱された∈パラメ〖タ〖¨士堆7改の荒答∷。妈2檬超においては、Emini数恕、Eminなど., J. Virolgy 55: 836 (1985) が、山烫澄惟を纷换するために蝗脱された∈パラメ〖タ〖¨山烫疯年嘎肠猛∈0.6∷♂1∷。妈3に、Karplus≥Schultz数恕、Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985) が、肩嚎嚼起拉を徒卢するために蝗脱された∈パラメ〖タ〖¨嚼起拉嘎肠猛∈0.2∷♂1∷。
≮0322≯
尸老の妈4第び妈5檬超においては、企肌菇陇の徒卢が、Chou-Fasmanの数恕、Chou, ∪Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition∩, in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), p.549-586 (1978) を脱いて、デ〖タに努脱された∈Chou-Fasman パラメ〖タ〖¨コンホメ〖ション山♂64タンパク剂〃β挝拌嘎肠猛♂105〃Grrnier-Robsonパラメ〖タ〖¨α第びβ疯年パラメ〖タ〖♂0∷。
≮0323≯
妈6のサブル〖チンにおいては、嚼起拉パラメ〖タ〖第び垮迹闻/拖寝儡夺拉傍灰が、∪钩付回眶∩として钙ばれる山烫呜吃猛を疯年するために寥圭された。呵姜弄に、ピ〖ク橙络怠墙が、钩付回眶に努脱され、柒婶挝拌に滦する山烫挝拌の败瓢刨に统丸する纳裁の极统エネルギ〖を纷换するために、それぞれのピ〖ク猛の20, 40, 60唆は80◇を烧裁することによって肩脱山烫ピ〖クを橙络する。しかしながら、この纷换は、ヘリカル挝拌がほとんど嚼起拉になる饭羹がないので、ヘリカル挝拌に赂哼するいずれかの肩脱ピ〖クにも努脱されなかった。
≮0324≯
この尸老の冯蔡は、芹误戎规2の肌のアミノ焕芹误が努磊な钩付拉尸灰を捏丁することを绩した¨アミノ焕1≥17、アミノ焕、アミノ焕102≥129、アミノ焕135≥142、アミノ焕146≥159第び、アミノ焕174≥182。塑券汤は、Ztnfr12に滦する钩挛を栏喇するためにそれらのアミノ焕芹误のいずれか1つの蝗脱を措茶する。塑券汤はまた、それらの钩付拉尸灰の警なくとも1つを崔んで喇るポリペプチドを措茶する。
≮0325≯
票屯に、Jameson-Wolf尸老の冯蔡は、芹误戎规13の肌のアミノ焕芹误が努磊な钩付拉尸老を捏丁することを绩した¨アミノ焕10≥26、アミノ焕45≥69、アミノ焕106≥113第びアミノ焕139≥151。塑券汤は、ネズミZtnfr12に滦する钩挛を栏喇するためへのそれらの钩付拉アミノ焕芹误のいずれか1つの芹误の蝗脱を措茶する。塑券汤はまた、それらの钩付拉尸灰の警なくとも1つを崔んで喇るポリペプチドにも簇する。
≮0326≯
铜脱な钩挛はまた、ヒト颁帕灰の警なくとも1つのZtnfr12エキソンを崔んで喇る钩付拉尸灰を脱いて栏喇され评る。毋えば、そのような钩付拉尸灰は、芹误戎规2の肌のアミノ焕芹误から喇るポリペプチドを崔んで喇ることができる¨アミノ焕荒答1≥45、アミノ焕荒答47≥122、第びアミノ焕荒答124≥184。
≮0327≯
ZTNF4によるシグナルトランスダクションを了贿する钩挛は、迹闻脱庞において铜脱であり评る。钩≥Ztnfr12钩挛の了贿は、毋えば、拣徵嘿甩废惧のZtnfr12へのビオチン≥ZTNF4冯圭のそれらの了巢により票年され评る。Ztnfr12嘿甩柒ドメインと冯圭する钩挛はまた、ZTNF4≥投券されたシグナルトランスダクションを了贿するためにも蝗脱され评る。そのような钩挛は、芹误戎规2のアミノ焕荒答101≥184柒のZtnfr12の嘿甩柒ドメインを冯圭することができる。さらに、材墙拉あるTRAF冯圭ドメインが、芹误戎规2のアミノ焕荒答159≥178で赂哼する。骄って、办年のシグナル≥了贿钩挛は、この挝拌柒のZtnfr12の嘿甩柒ドメインを冯圭することができる。塑券汤は、芹误戎规2のアミノ焕荒答159≥178柒のZtnfr12を冯圭する钩挛を蜀崔する。筛洁の数恕は、嘿甩の嘿甩柒措茶への钩挛の瞥掐のために网脱できる。毋えば、そのような钩挛は、リポソ〖ムに甚掐され评る。
≮0328≯
シグナル≥投券拉钩≥Ztnfr12钩挛はまた铜脱である。Ztnfr12减推挛に冯圭することによってシグナルを投券する钩挛はまた、啪继レポ〖タ〖妥燎第びZtnfr12を崔む努磊なレポ〖タ〖嘿甩废を脱いて票年され评る。毋绩のように、Ztnfr12を券附する、菇蜜された赢讫梧嘿甩废∈毋えば、Jurkat∷、第び啪继レポ〖タ〖颁帕灰は、レポ〖タ〖颁帕灰∈毋えば、ルシフェラ〖ゼ∷の啪继を簧枫するそれらの墙蜗について、钩≥Ztnf12モノクロ〖ナル钩挛を活赋するために蝗脱され评る。
≮0329≯
寥垂えZtnfr12タンパク剂、唆は欧脸富から帽违されたZtnfr12に滦するポリクロ〖ナル钩挛は、碰度荚に紊く梦られている数恕を脱いて拇澜され评る。毋えば、Green など., ∪Production of polyclonal Antisera,∩ in Immunochemical Protecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 第びWilliams など., ∪Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,∩ in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford University press 1995を徊救のこと。Ztnfr12ポリペプチドの倘敝付拉は、アジュバント、毋えばみょうばん∈垮焕步アルミニウム∷唆はフロイント窗链唆は稍窗链アジュバントの蝗脱を奶して光められ评る。
≮0330≯
倘敝步のために铜脱なポリペプチドはまた、突圭ポリペプチド、毋えばZtnfr12唆はその办婶と、倘敝グロブリンポリペプチド唆はマルト〖ス冯圭タンパク剂との突圭挛を蜀崔する。ポリペプチド倘敝付は、浇尸な墓さの尸灰唆はその办婶であり评る。ポリペプチド婶尸が∪ハプテン≥屯∩である眷圭、そのような婶尸は攻旁圭には、倘敝步のために光尸灰キャリヤ〖∈毋えば、カサガイヘモシアニン∈KLH∷、ウシ缝蓝アルブミン∈BSA∷唆は撬烬慎トキソイド∷に冯圭されるか唆は息冯され评る。
≮0331≯
ポリクロ〖ナル钩挛は诺房弄には、瓢湿、毋えば窍、淀、袱、奋、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ唆は陀において栏ぜしめられるが、塑券汤の钩≥Ztnfr12钩挛はまた、ヒトに夺い晤墓梧钩挛から投瞥され评る。ヒヒにおいて壳们弄に第び迹闻弄に铜脱な钩挛を栏ぜしめるための办忍弄な祷恕は、毋えばGoldenbergなど., 柜狠泼钓叫搓戎规WO91/11465规第びLosmanなど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に斧叫され评る。
≮0332≯
戮数では、モノクロ〖ナル钩≥Ztnfr12钩挛が栏喇され评る。泼年钩付に滦する喻货瓢湿モノクロ〖ナル钩挛は、碰度荚に梦られている数恕により评られる∈毋えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley など., ∪Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,∩ in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を徊救のこと)。
≮0333≯
缄没には、モノクロ〖ナル钩挛は、Ztnfr12颁帕灰栏喇湿を崔んで喇る寥喇湿をマウスに庙纪し、缝蓝サンプルを近殿することにより钩挛栏喇の赂哼を澄かめ、B≥リンパ靛を评るために纾隆を近殿し、ハイブリド〖マを栏喇するために涟淡リンパ靛を裹狂拣嘿甩により突圭し、ハイブリド〖マをクロ〖ニングし、钩付に滦する钩挛を栏喇する哇拉クロ〖ンを联买し、钩付に滦する钩挛を栏喇するクロ〖ンを禽蛙し、そしてハイブリド〖マ禽蛙湿から钩挛を帽违することに评られる。
≮0334≯
さらに、塑券汤の钩≥Ztnfr12钩挛は、ヒトモノクロ〖ナル钩挛から投瞥され评る。ヒトモノクロ〖ナル钩挛は、钩付苟封に炳批して泼年のヒト钩挛を栏喇するよう菇蜜されたトランスジェニックマウスから评られる。この祷恕においては、ヒトH嚎第びL嚎颁帕灰郝の妥燎が、柒傍拉H嚎第びL嚎颁帕灰郝の筛弄步された撬蝉を崔む骢创嘿甩废に统丸するマウス臭面に瞥掐される。トランスジェニックマウスは、ヒト钩付に滦して泼佰弄なヒト钩挛を圭喇することができ、そして涟淡マウスはヒト钩挛≥尸如拉ハイブリド〖マを栏喇するために蝗脱され评る。トランスジェニックマウスからヒト钩挛を评るための数恕は、Greenなど., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 第びTaylorなど., Inc. Immun. 6: 576, 1994により淡很される。
≮0335≯
モノクロ〖ナル钩挛は、硷」の浇尸に澄惟された祷恕により、ハイブリド〖マ禽蛙湿から帽违され、そして篮澜され评る。そのような帽违祷恕は、プロテイン≥Aセファロ〖スによる科下拉クロマトグラフィ〖、サイズ怯近クロマトグラフィ〖第びイオン蛤垂クロマトグラフィ〖を蜀崔する∈毋えば、Coligan, page 2.7.1-2.7.12第びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,∩ Purification of Imunoglobulin G (IgG)∩, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) を徊救のこと∷。
≮0336≯
泼年の脱庞に簇しては、钩≥Ztnfr12钩挛のフラグメントを拇澜することが疥司される。そのような钩挛フラグメントは、毋えば钩挛のタンパク剂裁垮尸豺により评られる。钩挛フラグメントは、骄丸の数恕による窗链な钩挛のペプシン唆はパパイン久步により评られる。毋绩のように、钩挛フラグメントは、F(ab∏)2として绩される5Sフラグメントを丁惦するためにペプシンによる钩挛の冠燎尸豺により栏喇され评る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab∏ 帽擦フラグメントを栏喇するためにチオ〖ル丛傅恨を脱いて尸豺され评る。
≮0337≯
扦罢には、その尸豺瓤炳は、ジスルフィド冯圭の尸豺に弹傍するスルフヒドリル答に簇するブロッキング答を脱いて乖われ评る。戮の缄檬としては、ペプシンを脱いての焕燎尸豺が2硷の帽疤Fabフラグメント第びFcフラグメントを木儡弄に栏喇する。それらの数恕は、毋えば、Goldenberg, アメリカ泼钓妈4,331,647规、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967), 第びColigan, p. 2.8.1-2.8.10第び2.10-2.10.4により淡很される。
≮0338≯
钩挛を尸豺する戮の数恕、毋えば帽擦L≥H嚎フラグメントを妨喇するためへのH嚎の尸豺、フラグメントの纳裁の尸豺、唆は戮の冠燎弄、步池弄唆は颁帕弄祷恕がまた、そのフラグメントが禄なわれていない钩挛により千急される钩付に冯圭する嘎り、蝗脱され评る。
毋えば、Fvフラグメントは、VH第びVL嚎の柴圭を崔んで喇る。この柴圭は、Inbar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により淡很のように、润鼎铜弄であり评る。戮数では、材恃嚎は、尸灰粗ジスルフィド冯圭により息冯され、唆は步池湿剂、毋えばグルテルアルデヒドにより蛤汗冯圭され评る∈毋えば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を徊救のこと∷。
≮0339≯
Fvフラグメントは、ペプチドリンカ〖により息冯されるVH第びVL嚎を崔んで喇る。それらの办塑嚎钩付冯圭タンパク剂∈scFv∷は、オリゴヌクレオチドにより息冯されるVH第びVLドメインをコ〖ドするDNA芹误を崔んで喇る菇陇颁帕灰を菇喇することによって拇澜される。菇陇颁帕灰が、鲁いて、缴肩嘿甩、毋えばE.コリ面に瞥掐される券附ベクタ〖面に赁掐される。寥垂え缴肩嘿甩は、2硷のVドメインを餐抖するリンカ〖ペプチドを铜する帽嚎ポリペプチドを圭喇する。ScFvを栏喇するための数恕は、毋えばWhitlow など., Methods: A Companion to Metheds in Enzymology 2:97, 1991により淡很される。Bird など., Science 242:423, 1988, Ladner など., アメリカ泼钓妈4,946,778规、Packなど., Bio/Technology 11: 1271, 1993第びSandhu, 涟淡も徊救のこと。
≮0340≯
毋绩のように、scFvは、インビトロで、Ztnfr12ポリペプチドにリンパ靛を私溪し、そしてファ〖ジ唆は梧击するベクタ〖における钩挛山绩ライブラリ〖を联买すること∈毋えば、盖年された唆はラベルされたZtnfr12タンパク剂唆はペプチドの侯脱を奶して∷によって评られる。材墙拉あるZtnfr12ポリペプチド冯圭ドメインを铜するポリペプチドをコ〖ドする颁帕灰は、ファ〖ジ∈ファ〖ジ山绩∷唆は嘿遁、毋えばEˉコリ惧に山绩されるランダムペプチドライブラリ〖をスクリ〖ニングすることによって评られる。涟淡ポリペプチドをコ〖ドするヌクレオチド芹误は、驴くの缄檬、毋えばランダム仆脸恃佰投券第びランダムポリヌクレオチド圭喇を奶して评られる。それらのランダムペプチド山绩ライブラリ〖は、タンパク剂唆はポリペプチドであり评る贷梦の筛弄湿、毋えばリガンド唆は减推挛、栏湿池弄唆は圭喇光尸灰、唆は铜怠唆は痰怠湿剂と陵高侯脱するペプチドについてスクリ〖ンするために蝗脱され评る。
≮0341≯
そのようなランダムペプチド山绩ライブラリ〖を料陇し、そしてスクリ〖ニングするための祷恕は、碰度肠において梦られており∈Ladner など., アメリカ泼钓妈5,223,409 规; Ladner など., アメリカ泼钓妈4,946,778 规〃Ladner など., アメリカ泼钓妈5,403,484 规第びLadner など., アメリカ泼钓妈5,571,698 规、第びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)∷、そしてランダムペプチド山绩ライブラリ〖第びそのようなライブラリ〖をスクリ〖ニングするためのキットは、毋えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 第びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から辉任されている。ランダムペプチド山绩ライブラリ〖は、Ztnfr12に冯圭するタンパク剂を票年するために、塑汤嘿今に倡绩されるZtnfr12芹误を脱いてスクリ〖ンされ评る。
≮0342≯
钩挛フラグメントのもう1つの妨は、帽办の陵输拉疯年挝拌∈CDR∷をコ〖ドするペプチドである。CDRペプチド∈∪呵井千急帽疤∩∷は、督蹋ある钩挛のDCRをコ〖ドする颁帕灰を菇喇することによって评られる。そのような颁帕灰は、毋えば钩挛≥栏喇嘿甩のRNAから材恃挝拌を圭喇するためにポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いることによって拇澜される∈毋えば、Larrick など., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, ∪Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,∩ in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 第びWard など., ∪Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,∩ in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を徊救のこと∷。
≮0343≯
もう1つの铜脱な钩≥减推挛钩挛はキメラ钩挛である。キメラ钩挛は、材恃ドメイン、第び喻货瓢湿钩挛に统丸する陵输拉疯年挝拌を崔んで喇り、そして钩挛尸灰の荒りはヒト钩挛に统丸する。毋えば、Verma and Boleti, ∪Engineering Antibody Molecules∩, in Diagnostic and Therapeutic Antibodies, George and Urch (Eds.), Pages 35-52 (Humana Press, Inc. 2000) を徊救のこと。
≮0344≯
戮数では、钩≥Ztnfr12钩挛は、∪ヒト步∩∈humanized∷モノクロ〖ナル钩挛から投瞥され评る。ヒト步モノクロ〖ナル钩挛は、マウス倘敝グロブリンH第びL材恃嚎からのマウス陵输拉疯年挝拌を、ヒト材恃ドメイン面に败乖することにより栏喇される。肌に、ヒト钩挛の诺房弄な荒答がネズミ滦炳湿の裹呈挝拌において弥垂される。ヒト步モノクロ〖ナル钩挛に统丸する钩挛喇尸の蝗脱は、ネズミ稍恃挝拌の倘敝付拉に簇息する材墙拉ある啼玛を搀闰する。ネズミ倘敝グロブリン材恃ドメインをクロ〖ン步するための办忍弄な祷恕は、毋えば、Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により淡很される。
≮0345≯
ヒト步モノクロ〖ナル钩挛を栏喇するための祷恕は、毋えば、Jones など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, ∪Engineering Therapeutic Antibodies,∩ in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 第びQueen など., アメリカ泼钓妈5,693,762规∈1997∷により淡很される。
≮0346≯
塑券汤は、Ztnfr12嘿甩嘲挝拌を冯圭する钩挛喇尸、第びTACI嘿甩嘲挝拌第びBCMA嘿甩嘲挝拌の警なくとも1つを冯圭する钩挛喇尸を崔んで喇る寥骏湿の蝗脱を蜀崔する。毋えば、そのような∪驴泼佰弄钩挛寥喇湿∩は、佰硷钩挛寒圭湿∈すなわち、佰なった冯圭泼佰拉をそれぞれ铜する、警なくとも2つの钩挛喇尸の礁圭挛∷、企泼佰弄钩挛∈すなわち、2つの佰なった冯圭婶疤を铜する钩挛喇尸∷、帽嚎企泼佰弄ポリペプチド、第び票屯のものを崔んで喇ることができる。
≮0347≯
企泼佰弄钩挛は、硷」の骄丸の数恕により澜陇され评る。毋绩としては、企泼佰弄钩挛は、佰なった钩挛の丛傅拉磊们に弹傍するFab∏フラグメントの焕步磊们により拇澜されて丸た。毋えば、Winterなど., Nature 349: 293 (1991) を徊救のこと。これは、2硷の佰なった钩挛のペプシン久步、Fab∏フラグメントの寒圭を妨喇するための丛傅拉磊们、鲁いて、傅のエピト〖プの改」に滦して泼佰弄なFab∏婶尸を崔む企泼佰弄钩挛を蜀崔するF(ab∏)2フラグメントの寒圭湿を栏喇するためにジスルフィド冯圭の焕步浩妨喇により栏喇される2硷の佰なったF(ab∏)2フラグメントを寒圭することによって乖われ评る。そのような企泼佰弄钩挛の拇澜のための办忍弄祷恕は、毋えばNisonhoffなど., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling など., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968) 第びアメリカ泼钓妈4,331,647规に斧叫され评る。
≮0348≯
戮数では、冯圭は、佰硷企幢墙擦リンカ〖、毋えばマレイミド≥ヒドロキシスクシンイミドエステルを脱いることによって茫喇され评る。钩挛唆はフラグメントと涟淡エステルとの瓤炳は涟淡钩挛唆はフラグメント惧のアミン答を投瞥挛步し、そして肌に、その投瞥挛は头违スルヒドリル答を铜する钩挛Fabフラグメント∈唆は、毋えばTrautの活挑によりそれに烧裁されるスルフヒドリル答を铜する络フラグメント唆は禄なわれていない钩挛∷と瓤炳せしめられ评る。そのようなリンカ〖は、票じ钩挛における答をたぶんほとんど餐抖せず、そして冯圭の联买拉を猖紊する。
≮0349≯
もう1つの毋绩として、企泼佰弄F(ab∏)2钩挛は、企幢墙擦餐抖恨o≥フェニレンジマレイミドを脱いて、それらのヒンジ挝拌SH答を奶して2硷のFab∏フラグメントを息冯することによって栏喇され评る。毋えば、Tso, ∪F(ab∏)2 Fusion Proteins and Bispecific F(ab∏)2∩ in Chamow and Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, Pages 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999), and french, ∪How to Make Bispecific Antibodies∩, in George and Urch (Eds.), Diagnostic and Therapeutic Antibodies, pages 333-339 (Humana Press, Inc. 2000) を徊救のこと。
≮0350≯
钩付冯圭婶疤から斌く违れた婶疤で钩挛唆はフラグメントを冯圭することは攻旁圭である。これは、毋えば、惧淡に绩されるように、磊们された嚎粗スルフヒドリル答への息冯により茫喇され评る。もう1つの数恕は、焕步された煤垮步湿婶尸を铜する钩挛と、警なくとも1つの头违アミン怠墙を铜するもう1つの钩挛とを瓤炳せしめることを蜀崔する。これは、毋えば呵姜剩圭挛を妨喇するために、怙垮燎步圭湿丛傅による妈企アミンへの丛傅により奥年步され评る介袋シッフ宾答∈イミン∷冯圭をもたらす。そのような婶疤泼佰弄冯圭は、井さな尸灰に簇しては、アメリカ泼钓妈4,671,958规に倡绩され、そして络きな烧裁湿に簇しては、アメリカ泼钓妈4,699,784规に倡绩されている。
≮0351≯
戮数では、企泼佰弄钩挛は、2硷のハイブリド〖マ嘿甩废∈1つの嘿甩废は钩≥Ztnfr12モノクロ〖ナル钩挛を栏喇し、そしてもう1つの嘿甩废は钩≥BCMAモノクロ〖ナル钩挛唆は钩〗TACIモノクロ〖ナル钩挛のいずれかを栏喇する∷を突圭することによって栏喇され评る。テトラド〖マを栏喇するための祷恕は、毋えばMilsteinなど., Nature 305: 538 (1983) 第びPohlなど., Inc. J. Cancer 54: 418 (1993) により淡很される。
≮0352≯
企泼佰弄钩挛はまた、颁帕灰供池により栏喇され评る。毋えば、钩≥Ztnfr12モノクロ〖ナル钩挛の材恃ドメインをコ〖ドするDNAを崔むベクタ〖が、钩≥TACI钩挛唆は钩≥BCMA钩挛を尸如するハイブリド〖マ面に瞥掐され评る。その评られる妨剂啪垂挛は、Ztnfr12、第びBCMA唆はTACIのいずれかを冯圭する企泼佰弄钩挛を栏喇する。戮数では、钩≥Ztnfr12冯圭ドメイン、第び警なくとも1つの钩≥BCMA冯圭ドメイン唆は钩〗TACI冯圭ドメインをコ〖ドするキメラ颁帕灰が措茶され评る。
≮0353≯
企泼佰弄钩挛を栏喇するための硷」の颁帕弄数恕が碰度荚に掐缄できる。1つのアプロ〖チにおいては、毋えば企泼佰弄F(ab∏)2がロイシンジッパ〖を脱いて栏喇され评る。毋えばTso, ∪F(ab∏)2 Fusion Proteins and Bispecific F(ab∏)2∩ in Chamow and Ashkenazi (Eds.), Antibody Fusion Proteins, pages 127-150 (Wiley-Liss, Inc. 1999) を徊救のこと。颁帕灰供池により企泼佰弄钩挛を栏喇するための办忍弄祷恕は、毋えばSongsivilaiなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 271 (1989), Trauneckerなど., EMBO J. 10: 3655 (1991) 第びWeinerなど., J. Immunol. 147: 4035 (1991) により淡很される。
≮0354≯
塑券汤の企泼佰弄尸灰はまた、办塑嚎企泼佰弄尸灰、毋えば办塑嚎企泼佰弄钩挛、办塑嚎钩挛第び冯圭疯年答を崔んで喇る办塑嚎企泼佰弄尸灰、唆は2硷の冯圭疯年答を崔んで喇る办塑嚎企泼佰弄尸灰であり评る。
企泼佰弄钩挛は、筛洁祷恕、毋えば企泼佰弄ELISAを脱いてスクリ〖ンされ评る。
≮0355≯
塑券汤はさらに、筛洁祷恕を脱いて、钩≥Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントにより瓢湿を倘敝步することによって拇澜され评るポリクロ〖ナル钩≥イディオタイプ钩挛を蜀崔する。毋えば¨Immunochemical Protocols, Madison (ed.), Pages 1-12 (Humana Press 1992) 第びColigan, pages 2. 4. 1-2. 4. 7を徊救のこと。
≮0356≯
戮数では、モノクロ〖ナル钩≥イディオタイプ钩挛は、惧淡の祷恕により、钩≥Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントを倘敝付として脱いて拇澜され评る。もう1つの数恕として、ヒト步钩≥イディオタイプ钩挛唆は客粗に夺い晤墓梧钩≥イディオタイプ钩挛が、惧淡祷恕を脱いて拇澜され评る。钩≥イディオタイプ钩挛を拇澜するための数恕は、毋えばIrie, アメリカ泼钓妈5,208,146规, Greeneなど., アメリカ泼钓妈5,637,677规、第びVarthakovi and Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996により淡很される。
≮0357≯
塑券汤の钩≥Ztnfr12钩挛喇尸第び钩≥インディオタイプ钩挛は、プレ≥B唆はB≥嘿甩球缝陕、毋えば缝搦嘿甩球缝陕、她拉唆は缔拉リンパ靛球缝陕、裹狂拣、毋えば驴券栏裹狂拣、缝搦嘿甩裹狂拣、柒乳裹狂拣第び叼嘿甩裹狂拣、第びリンパ拣、毋えば润≥ホドキンスリンパ拣∈Ztnfr12リガンド、毋えばZTNF4の惧竞に簇息する∷を借妄するためにZtnfr12リガンド∈毋えば、ZTNF4∷の跟蔡を面下するのに铜脱である。塑汤嘿今に淡很される尸灰により借妄され评るB嘿甩リンパ拣の纳裁の毋は、バ〖キットリンパ拣、润バ〖キットリンパ拣、井甩拉リンパ拣、缔拉リンパ碴球缝陕、络嘿甩房リンパ拣、董肠挝拌リンパ拣、蕊遂嘿甩リンパ拣、络嘿甩房リンパ拣∈毋えば、倘敝碴靛拉リンパ拣∷、井リンパ靛拉リンパ拣第び戮のB嘿甩リンパ拣を蜀崔する。
≮0358≯
10ˉ颁帕灰券附第び颁帕灰菇陇を浮叫するためへのZtnfr12ヌクレオチド芹误の蝗脱
乘焕尸灰は、栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12颁帕灰の券附を浮叫するために蝗脱され评る。努磊なプロ〖ブ尸灰は、芹误戎规1のヌクレオチド芹误、唆はその办婶を崔んで喇る企塑嚎乘焕尸灰、第び芹误戎规1のヌクレオチド芹误の输挛、唆はその办婶を铜する1塑嚎乘焕尸灰を蜀崔する。塑汤嘿今において蝗脱される眷圭、脱胳∪办婶∩とは、警なくとも8改のヌクレオチド×警なくとも20改唆はそれ笆惧のヌクレオチドを咐第する。毋绩弄なプロ〖ブは、戮の拣徵蝉秽傍灰减推挛颁帕灰における陵碰の挝拌に滦して你い芹误梧击拉を铜する、Ztnfr12颁帕灰の挝拌と冯圭する。
≮0359≯
答塑弄アッセイにおいては、办塑嚎プロ〖ブ尸灰が、プロ〖ブと筛弄Ztnfr12 RNA硷との粗の宾答滦圭を楼渴する、补刨第びイオン动刨の掘凤布で、栏湿池弄サンプルから帽违されたRNAと鼎にインキュベ〖トされる。琐冯圭のプロ〖ブをハイブリダイズされた尸灰から尸违した稿、ハイブリッドの翁が浮叫される。
≮0360≯
RNA浮叫の浇尸に澄惟されたハイブリダイゼ〖ション数恕は、ノザン尸老第びドット/スロット ブロットハイブリダイゼ〖ションを蜀崔する∈毋えば、Ausubel 涟淡、p4≥1×4≥27、第びWuなど. (eds.)、∩Analysis of Gene Expression at the RNA Level∩, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-39, CRC Press, Inc., 1997を徊救のこと∷。乘焕プロ〖ブは、庶纪拉票疤挛、毋えば32P唆は35Sにより浮叫できるようラベルされ评る。戮数では、Ztnfr12 RNAは、润庶纪拉ハイブリダイゼ〖ション数恕により浮叫され评る∈毋えば、Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993を徊救のこと∷。诺房弄には、润庶纪墙拉浮叫は、クロモゲン唆は步池ルミネセンス答剂の冠燎啪垂により茫喇される。毋绩弄な润庶纪拉喇尸は、ビオチン、フルオレセイン第びジゴキシゲニンを蜀崔する。
≮0361≯
Ztnfr12オリゴヌクレオチドプロ〖ブはまた、インビボ壳们のためにも铜脱である。毋绩として、16F≥ラベルされたオリゴヌクレオチドが滦据に抨涂され、そして哇排灰纪叫们霖唬逼恕により材浑材され评る∈Tavitian など., Nat. Med. 4: 467, 1998∷。
≮0362≯
驴くの壳们数恕は、浮叫数恕の炊刨を光めるために、ポリメラ〖ゼ嚎瓤炳∈PCR∷を网脱する。PCRを悸卉するための筛洁祷恕は紊く梦られている∈办忍弄には、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humana Press, Inc., 1993; Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer, Humana Press, Inc., 1996; Hanausek and Walaszed (eds.), Tumor Marker Protocols, Humana Press, Inc., 1998; Lo (ed.), Clinical Applications of PCR, Humana Press, Inc., 1998第びMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis, Humana Press, Inc., 1998を徊救のこと∷。
≮0363≯
PCRプライマ〖は、戮のタンパク剂、毋えば、戮の拣徵蝉秽傍灰减推挛タンパク剂における陵碰の挝拌に滦して你い芹误梧击拉を铜するZtnfr12颁帕灰の办婶を笼升するよう措茶される。
≮0364≯
壳们アッセイについてのPCRの1つの恃恕は、嫡啪继冠燎≥PCR∈RT≥PCR∷である。RT≥PCR祷恕においては、RNAが栏湿池弄サンプルから帽违され、cDNAに嫡啪继され、そしてそのcDNAがZtnfr12プライマ〖と鼎にインキュベ〖トされる∈毋えば、Wuなど. (eds.), ∪Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR∩, in Methods in Gene Biotechnology, P. 15-28, CRC Press, Inc. 1997を徊救のこと∷。肌に、PCRが乖われ、そして栏喇湿が筛洁祷恕を脱いて尸老される。
≮0365≯
毋绩のように、RNAは、毋えば惧淡グアニジニウム≥チオシアネ〖ト嘿甩拖豺を脱いて、栏湿池弄サンプルから帽违される。戮数では、盖陵祷恕が、嘿甩拖豺湿からmRNAを帽违するために蝗脱され评る。嫡啪继瓤炳は、ランダムオリゴヌクレオチド、dTの没いホモポリマ〖、唆はZtnfr12アンチセンスオリゴマ〖を脱いて、帽违されたRNAにより炊侯され评る。オリゴ≥dTプライマ〖は、滦救の筛弄芹误を捏丁することができる硷」のmRNAヌクレオチド芹误が笼升される网爬を捏丁する。Ztnfr12芹误は、诺房弄には20改の墓さの宾答である2硷のフランキングオリゴヌクレオチドプライマ〖を脱いてポリメラ〖ゼ嚎瓤炳により笼升される。
≮0366≯
PCR笼升数恕は、硷」のアプロ〖チを脱いて浮叫され评る。毋えば、PCR栏喇湿は、ゲル排丹彼瓢により尸侍され、そして江步エチジウム厉咖により材浑步される。戮数では、尸侍されたPCR栏喇湿は、遂に败乖され、浮叫できるようにラベルされたZtnfr12プロ〖ブによりハイブリダイズされ、そしてオ〖トラジオグラフィ〖により活赋され评る。纳裁の戮のアプロ〖チは、步池ルミネセンス浮叫第びC≥TRAK孺咖アッセイを捏丁するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ乘焕话ミリ焕の蝗脱を蜀崔する。
≮0367≯
Ztnfr12券附の浮叫のためのもう1つのアプロ〖チは、サイクリングプロ〖ブ祷恕∈CDT∷であり、ここで办塑嚎DNA筛弄湿が册娟のDNA≥RNA≥DNAキメラプロ〖ブと冯圭し、剩圭挛を妨喇し、RNA婶尸がRNア〖ゼHにより尸步され、そして尸豺されたプロ〖ブの赂哼が浮叫される∈毋えば、Beggsなど., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996, 第び Bekkuouiなど., Biotechniques 20: 240, 1996を徊救のこと∷。Ztnfr12芹误の浮叫のための戮の数恕は、乘焕芹误に答づく笼升∈NASBA∷、蛤汗ハイブリダイゼ〖ションによる抿房の定票笼升∈CATCH∷第びリガ〖ゼ嚎瓤炳∈LCR∷のようなアプロ〖チを网脱することができる∈毋えば、Marshallなど., アメリカ泼钓妈5,686,272规∈1997∷、Dyerなど., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehrichtなど., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997; 第びChadwickなど., J. Viro. Methods 70:59, 1998を徊救のこと∷。戮の筛洁数恕も碰度荚に梦られている。
≮0368≯
Ztnfr12プロ〖ブ第びプライマ〖はまた、寥骏サンプルにおけるZtnfr12颁帕灰券附を浮叫し、そして疤弥疯年するためにも蝗脱され评る。そのような附眷ハイブリダイゼ〖ションのための数恕は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Choo (ed.), In situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; We など. (eds.), ∪Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH), ∪ in Methods in Gene Biotechnology, pages 259-278, CRC Press, Inc., 1997; 第びWuなど. (eds.), ∪Localizaion of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),∩ in Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289, CRC Press, Inc., 1997を徊救のこと∷。
≮0369≯
硷」の纳裁の壳们アプロ〖チも碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996; 第びElles, molecular Diagnosis of Genetics Diseases, Humana Press Inc., 1996を徊救のこと∷。努磊な活赋サンプルは、缝闭、洽、旅闭、寥骏、栏浮第び浮秽を蜀崔する。
≮0370≯
Ztnfr12颁帕灰は、厉咖挛22q13.2、すなわち、祭陕第び俱巢、毋えばFechtner旧铬凡、Sorsby布婶ジストロフィ〖、岂陌、第び攻面靛倘敝风禄旧铬凡に簇息する挝拌に赂哼する。さらに、サイトカイン减推挛の仆脸恃佰は泼年の祭陕に簇息している。毋えば、サイトカイン减推挛の驴妨附据は、琴甩タンパク剂旧、踩虏拉件袋拉券钱第び乐球缝陕に簇息している。骄って、Ztnfr12ヌクレオチド芹误は、硷」の祭陕についての息嚎に答づく活赋において、第び滦据の厉咖挛がZtnfr12颁帕灰に仆脸恃佰を崔むかどうかを疯年するために蝗脱され评る。Ztnfr12颁帕灰郝での浮叫できる厉咖挛帮忙は、佰眶拉、颁帕灰コピ〖眶恃步、赁掐、风己、扩嘎婶疤恃步第び啪疤を蜀崔するが、芒しそれらだけには嘎年されない。Ztnfr12颁帕灰を稍宠拉步する颁帕灰恃构が泼に督蹋の滦据である。
≮0371≯
Ztnfr12颁帕灰郝に簇息する帮忙は、尸灰颁帕灰祷恕、毋えば扩嘎フラグメント墓さ戮房附据尸老、PCR祷恕を脱いる没いタンデム瓤牲挛尸老、笼升≥稍炳拉仆脸恃佰システム尸老、办塑嚎コンホメ〖ション驴房附据浮叫、RNア〖ゼ磊们数恕、恃拉グラジエントゲル排丹彼瓢、分各≥锦蜗のミスマッチ尸老、第び碰度肠において梦られている戮の颁帕灰尸老により、塑券汤の乘焕尸灰を脱いて浮叫され评る∈毋えば、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press. Inc. 1991), Marian, Chest 108¨255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnositics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Morecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Burren など. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Habor Laboratory Press 1998), Dracopoli など. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), 第びRichards and Ward, ∪Molecular Diagnostic Testing,∩ in Principles of Molecular Medicine, Pages 83-88 (Humana Presa. Inc. 1998) を徊救のこと∷。
≮0372≯
毋绩として、Ztnfr12颁帕灰における络きな风己は、サザンハイブリダイゼ〖ション尸老唆はPCR笼升を脱いて浮叫され评る。泼年のZtnfr12エキソンにおける风己は、エキソンを尉眉に铜するPCRプライマ〖を脱いて浮叫され评る。山1は、芹误戎规1第び9のヌクレオチド芹误に赂哼するZtnfr12エキソンの疤弥を捏丁する。この攫鼠は、泼年のエキソンを笼升するプライマ〖を措茶するために蝗脱され评る。
≮0373≯
仆脸恃佰はまた、赖撅なZtnfr12芹误を崔んで喇るオリゴヌクレオチドプロ〖ブを、サザンブロット唆は遂冯圭されたPCR栏喇湿にハイブリダイズすることによって浮叫され评る。急侍は、光い钝教拉の掘凤布でハイブリダイズするか、唆は硷」の钝教掘凤布で丽爵することによって茫喇され评る。この尸老は、泼年のコ〖ド芹误に筛弄步され评る。戮数では、このアプロ〖チは、祭陕付傍の仆脸恃佰がしばしば疤弥する、篓箕フランキングイントロン芹误におけるスプライス≥ドナ〖唆はスプライス≥减推挛婶疤を活赋するために蝗脱される。努磊なオリゴヌクレオチドは、山1、第び芹误戎规1第び9に捏丁される攫鼠を脱いて、联买のエキソン面に芹误を变墓することによって措茶され评る。
≮0374≯
颁帕灰のすべて唆は办婶の脚剩は、その脚剩された湿剂が颁帕灰の粕み艰り先面に赁掐され、そして溯条の踏较姜冯を苞き弹こす眷圭、俱巢を苞き弹こすことができる。脚剩第び赁掐は、筛洁数恕、第びサザンハイブリダイゼ〖ション、分各附眷ハイブリダイゼ〖ション、パルスされたフィ〖ルドゲル尸老、唆はPCRにより滦据のゲノムDNAを尸老することによって木儡弄に活赋され评る。さらに、脚剩の跟蔡は、布淡に淡很されるタンパク剂磊们アッセイにより浮叫され评る。
≮0375≯
爬仆脸恃佰は、Ztnfr12怠墙の恃构、唆はアミノ焕コドンの匿贿コドンへの恃步をもたらす润瘦赂拉恃步を瞥くことができる。爬仆脸恃佰がイントロン柒で栏じる眷圭、その仆脸恃佰はスプライシングの努圭拉に逼读を第ぼすことができる。爬仆脸恃佰は、筛洁祷恕、毋えばサザンハイブリダイゼ〖ション尸老、PCR尸老、芹误疯年、息冯嚎瓤炳第び戮のアプロ〖チを脱いて浮叫され评る。办塑嚎芹郝驴妨附据尸老においては、PCRにより笼升されたフラグメントが办塑嚎に尸违され、そして恃拉掘凤布でポリアクリルアミドゲル排丹彼瓢により尸老される。
≮0376≯
ゲルを奶しての败瓢庐刨が、宾答芹误に巴赂する芹郝の簇眶である。仆脸恃佰は1つの唆は尉荚の办塑嚎の败瓢庐刨を恃构することができる。步池弄尸老アプロ〖チにおいては、ハイブリッド尸老が活赋DNAと滦救DNA∈毋えば、芹误戎规2のアミノ焕芹误をコ〖ドするDNA∷との粗で栏喇される。仆脸恃佰による宾答滦ミスマッチの婶疤が疙って滦圭され、そして嚎はそれらの婶疤での步池弄尸老に滦して梢炊になるであろう。
≮0377≯
タンパク剂磊们活赋はまた、溯条≥姜冯仆脸恃佰がコ〖ドされたタンパク剂の办婶のみを栏喇する、颁帕灰の稍宠拉步を浮叫するために铜脱である∈毋えば、Stoppa-Lynnet など., Blood 91: 3920 (1998) を徊救のこと∷。このアプロ〖チによれば、RNAが栏湿池弄サンプルから帽违され、そしてcDNAを圭喇するために蝗脱される。肌に、PCRが、Ztnfr12筛弄湿芹误を笼升し、そしてRNAポリメラ〖ゼプロモ〖タ〖、溯条倡幌芹误第びインフレ≥ムATGトリプレットを瞥掐するために蝗脱される。PCR栏喇湿が、RNAポリメラ〖ゼを脱いて啪继され、そして啪继挛がT7≥冯圭された讨屯挛拖豺湿システムによりインビトロで溯条される。肌に、溯条栏喇湿が、その溯条栏喇湿の墓さを疯年するために、SDS≥PAGEにより尸侍される。タンパク剂磊们活赋は、毋えば、Dracopoliなど. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, p.9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998) により淡很される。
≮0378≯
戮のアプロ〖チにおいては、仆脸恃佰は、芹误ミスマッチの婶疤でRNA≥DNAハイブリッドのRNA嚎を尸豺するであろう、リボヌクレア〖ゼAを脱いて浮叫され评る。缄没には、滦据のZtnfr12颁帕灰唆はcDNAのPCR≥笼升された芹误が、办忍弄礁媚から联买された赖撅で夫汞な改客のDNAから拇澜された、インビトロで啪继された、ラベルされたRNAプロ〖ブによりハイブリダイズされる。RNA≥DNAハイブリッドが、リボヌクレア〖ゼAにより久步され、そして恃拉ゲル排丹彼瓢を脱いて尸老される。2塑の嚎粗の芹误ミスマッチは瘦割されたフラグメントの尸老を苞き弹こし、そして井さな纳裁のフラグメントは、仆脸恃佰投券されたZtnfr12颁帕灰を铜する滦据に统丸するサンプルにおいて浮叫されるであろう。仆脸恃佰の婶疤は、尸豺栏喇湿のサイズから夸年され评る。
≮0379≯
Ztnfr12ポリヌクレオチド芹误を脱いての厉咖挛DNAの尸老は、厉咖挛22q、 泼に厉咖挛22q13.2に疤弥する佰撅拉と祭陕とを簇息づけるために铜脱である。1つの轮屯においては、塑券汤の数恕は、∈a∷改客からのサンプルからZtnfr12 RNAを惩评し、∈b∷Ztnfr12 cDNAをポリメラ〖ゼ嚎瓤炳により栏喇し、そして∈c∷芹误戎规1に绩されるような乘焕芹误に、涟淡Ztnfr12 cDNAのヌクレオチド芹误を孺秤することを崔んで喇る、涟淡サンプルにおける厉咖挛22q13.2佰撅拉を浮叫するための数恕を捏丁する。さらなる轮屯においては、サンプルにおけるZtnfr12 cDNA唆はZtnfr12颁帕灰の芹误と芹误戎规1唆は9に绩されるようなZtnfr12芹误との粗の汗佰が、厉咖挛22q13.2佰撅拉を绩す。
≮0380≯
もう1つの轮屯においては、塑券汤は、∈a∷改客からのサンプル面の乘焕尸灰と芹误戎规1のヌクレオチド芹误、その输挛唆はフラグメントから喇る乘焕尸灰に钝教掘凤布でハイブリダイズする乘焕プロ〖ブとを儡卡せしめ、そして∈b∷涟淡サンプルにおける乘焕尸灰との涟淡プロ〖ブのハイブリダイゼ〖ションの赂哼を浮叫し、ここで涟淡ハイブリダイゼ〖ションの厉咖挛22q13.2佰撅拉、毋えばZTNF4に滦する炳批の你布を苞き弹こす佰撅拉を山す檬超を崔んで喇る、ZtNF4宠拉の恃构に簇息する厉咖22q13.2佰撅拉を涟淡サンプルにおいて浮叫するための数恕を捏丁する。
≮0381≯
塑券汤はまた、∈a∷改客からのサンプルからZtnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰を帽违し、そして∈b∷涟淡帽违されたZtnfr12コ〖ドの芹误のヌクレオチド芹误と芹误戎规1のヌクレオチド芹误とを孺秤することを崔んで喇る、ZTNF4宠拉における恃构に簇息するZtnfr12颁帕灰佰撅拉を、涟淡サンプルにおいて浮叫する数恕を捏丁し、ここで涟淡帽违されたZtnfr12コ〖ドの芹误、唆は涟淡帽违されたZtnfr12コ〖ドの芹误から栏喇されたZtnfr12ポリペプチドをコ〖ドするポリヌクレオチドと、芹误戎规1のヌクレオチド芹误との粗の汗佰が、改客における祭陕唆は祭陕に滦する炊减拉に簇息するZtnfr12颁帕灰佰撅拉、毋えばZTNF4に滦する炳批拉の你布を苞き弹こす佰撅拉を山す。
≮0382≯
塑券汤はまた、∈a∷改客からのサンプルからZtnfr12 RNAを惩评し、∈b∷涟淡Ztnfr12 RNAからポリメラ〖ゼ嚎瓤炳によりZtnfr12 cDNAを栏喇し、そして∈c∷涟淡Ztnfr12 cDNAのヌクレオチドと芹误戎规1のヌクレオチド芹误とを孺秤することを崔んで喇る、祭陕唆は祭陕に滦する炊减拉に簇息するZtnfr12颁帕灰の券附の佰撅拉を、涟淡サンプルにおいて浮叫する数恕を捏丁し、ここで涟淡Ztnfr12 cDNAの芹误と、芹误戎规1のヌクレオチド芹误との汗佰が、祭陕唆は祭陕に滦する炊减拉に簇息するZTNFR12颁帕灰の券附の佰撅拉を山す。
≮0383≯
戮の囱爬においては、塑券汤は、∈a∷サンプル乘焕尸灰と、芹误戎规1のヌクレオチド芹误、その输挛唆はフラグメントを铜する乘焕尸灰に钝教掘凤布でハイブリダイズする乘焕プロ〖ブとを儡卡せしめ、そして∈b∷ハイブリダイゼ〖ションの赂哼唆は稍哼を浮叫することを崔んで喇る、Ztnfr12颁帕灰佰撅拉を、涟淡サンプルにおいて浮叫するための数恕を捏丁し、ここで涟淡ハイブリダイゼ〖ションの赂哼がZtnfr12佰撅拉を绩す。
≮0384≯
附眷ハイブリダイゼ〖ションは、Ztnfr12颁帕灰佰撅拉を票年するためのもう1つのアプロ〖チを捏丁する。このアプロ〖チによれば、Ztnfr12プロ〖ブが、碰度肠において梦られているいずれかの数恕に骄って、浮叫できるマ〖カ〖によりラベルされる。毋えば、プロ〖ブは、ランダムプライミング、琐眉ラベリング、PCR、唆はニック溯条により木儡弄にラベルされ评る。努磊な木儡弄ラベルは、庶纪拉ラベル、毋えば32P, 3H第び35S, 第び润庶纪拉ラベル、毋えば分各マ〖カ〖∈毋えば、フルオレセイン、Texas Red, AMCAブル〖∈7≥アミノ≥4≥メチル≥クマリン≥3≥アセテ〖ト∷、ルシファ〖イエロ〖、ロ〖ダミン、霹∷、シアニン厉瘟∈材浑各により浮叫できる∷、冠燎第び票屯のものを蜀崔する。
≮0385≯
焕燎によりラベルされたプロ〖ブは、その冠燎のための答剂を捏丁することによって孺咖瓤炳を奶して浮叫され评る。硷」の答剂の赂哼布で、佰なった咖禾が瓤炳により栏喇され、そしてそれらの咖禾は、疥司により、剩眶のプロ〖ブを侍」に浮叫するために材浑步され评る。アルカリホスファタ〖ゼのための努磊な答剂は、5≥ブロモ≥5≥クロロ≥3≥インドリルホスフェ〖ト第びニトロブル〖テトラゾリウムを蜀崔する。ホ〖スラディシュペルオキシダ〖ゼのための1つの努磊な答剂はジアミノベンゾエ〖トである。
≮0386≯
附眷ハイブリダイゼ〖ションによる厉咖挛佰撅拉を浮叫するための毋绩弄数恕は、Wangなど., アメリカ泼钓妈5,856,089规により淡很される。このアプロ〖チに骄って、毋えば滦据から评られた盖年された寥骏サンプルから嘿甩における厉咖挛菇喇佰撅拉を浮叫するためのZtnfr12プロ〖ブによる附眷ハイブリダイゼ〖ションを乖うための数恕は、
∈1∷吹荚からの盖年された寥骏サンプルを惩评し、
∈2∷檬超∈1∷において评られた盖年された寥骏サンプルを、啊尾焕垮燎イオン寥喇湿により涟借妄し、
∈3∷涟淡盖年された寥骏サンプルをプロテイナ〖ゼにより久步し、
≮0387≯
∈4∷檬超∈3∷の久步された、盖年された寥骏サンプルから评られる嘿甩に滦して、Ztnfr12颁帕灰に滦して泼佰弄にハイブリダイズするプロ〖ブにより附眷ハイブリダイゼ〖ションを乖い、ここでハイブリダイズされたプロ〖ブのシグナルパタ〖ンが评られ、
∈5∷督蹋ある赖撅な疯年弄厉咖挛挝拌を铜する嘿甩に滦する附眷ハイブリダイゼ〖ションを乖う眷圭に评られるハイブリダイズされたプロ〖ブの徒年されたシグナルパタ〖ンに、檬超∈4∷でのハイブリダイズされたプロ≥グのシグナルパタ〖ンを孺秤し、そして
∈6∷檬超∈4∷で评られたシグナルパタ〖ンと涟淡徒年されるシグナルパタ〖ンとの粗の汗佰を浮叫することによって、涟淡吹荚の嘿甩における厉咖挛菇陇佰撅拉を浮叫する檬超を崔んで喇る。Ztnfr12颁帕灰佰撅拉の毋は、风己、笼升、トランスロケ〖ション、嫡疤第び票屯のものを蜀崔する。そのようなアッセイは、毋えばZTNP4に滦する恃构された炳批拉に簇息する祭陕唆は俱巢を铜すると蛔われる滦据からの寥骏を活赋するために蝗脱され评る。
≮0388≯
塑券汤はまた、Ztnfr12颁帕灰券附のための壳们アッセイを乖うための唆はZtnfr12颁帕灰における仆脸恃佰を浮叫するためのキットも措茶する。そのようなキットは、乘焕プロ〖ブ、毋えば芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误、芹误戎规1のヌクレオチド27≥233のヌクレオチド芹误、唆はその办婶を崔んで喇る企塑嚎尸灰、第び芹误戎规1のヌクレオチド27≥578のヌクレオチド芹误、芹误戎规1のヌクレオチド27≥233のヌクレオチド芹误、唆はその办婶を铜する办塑嚎乘焕尸灰を崔んで喇る。プロ〖ブ尸灰は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド第び票屯のものであり评る。キットは、PCRを乖うための乘焕プライマ〖を崔んで喇る。
≮0389≯
そのようなキットは、惧淡乘焕壳们アッセイを乖うためのすべての涩妥な妥燎を崔むことができる。キットは、Ztnfr12プロ〖ブ唆はプライマ〖を崔んで喇る警なくとももう1つの推达を崔むであろう。キットはまた、Ztnfr12芹误の赂哼を绩すことができる1唆は剩眶の活挑を崔んで喇る妈2推达を崔むことができる。そのようなインジケ〖タ〖活挑の毋は、浮叫できるラベル、毋えば庶纪拉ラベル、分各咖燎、步池ルミネセント恨、第び票屯のものを蜀崔する。
≮0390≯
キットはまた、Ztnfr12プロ〖ブ第びプライマ〖がZtnfr12颁帕灰券附を浮叫するために蝗脱される、蝗脱荚に梦られるための缄檬を崔んで喇る。毋えば、矢今の棱汤今は、甚掐されている乘焕尸灰が、Ztnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰、唆はZtnfr12コ〖ドのヌクレオチド芹误に滦して陵输弄であるヌクレオチド芹误を铜する乘焕尸灰のいずれかを浮叫するために蝗脱され评ることを淡很する。その矢今の亨瘟は、推达に木儡弄に努脱され、唆は矢今の亨瘟は、パッケ〖ジング赁掐挛の妨で捏丁され评る。
≮0391≯
11ˉZtnfr12を浮叫するためへの钩≥Ztnfr12钩挛の蝗脱
塑券汤は、Ztnfr12の赂哼についてインビトロで栏湿池弄サンプルをスクリ〖ンするためへの钩≥Ztnfr12钩挛の蝗脱を措茶する。1つのタイプのインビトロアッセイにおいては、钩≥Ztnfr12钩挛が闭陵において蝗脱される。毋えば、栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12の赂哼は、栏湿池弄サンプルと、腮翁のラベルされたZtnfr12第び钩≥Ztnfr12钩挛とを、Ztnfr12とその钩挛との粗の冯圭を楼渴する掘凤布で寒圭することによって活赋され评る。サンプルにおけるZtnfr12第び钩≥Ztnfr12の剩圭挛が、涟淡剩圭挛を、钩挛、毋えばFc钩挛唆はスタフィロコ〖カスタンパク剂Aと冯圭する票年されたタンパク剂とを儡卡することによって、瓤炳寒圭湿から尸违され评る。栏湿池弄サンプルにおけるZtnfr12の腔刨は、钩挛に冯圭されるラベルされたZtnfr12の翁に瓤孺毋し、そして头违ラベルにされたZtnfr12の翁に木儡弄に簇息する。毋绩弄な活赋サンプルは、缝闭、洽、旅闭、寥骏栏浮第び浮秽亨瘟を蜀崔する。
≮0392≯
戮数では、钩≥Ztnfr12钩挛が盖陵キャリヤ〖に冯圭されるインビトロアッセイが乖われ评る。毋えば、钩挛が、稍拖拉毁积挛、毋えばポリマ〖≥蕊胜されたビ〖ズ、プレ〖ト唆は瓷に钩挛を冯圭するために、ポリマ〖、毋えばアミノデキストランに冯圭され评る。戮の努磊なインビトロアッセイは、碰度荚に汤らかであろう。
≮0393≯
もう1つのアプロ〖チにおいては、钩≥Ztnfr12钩挛が、栏浮浮挛から拇澜された寥骏磊室においてZtnfr12を浮叫するために蝗脱され评る。そのような倘敝步池弄浮叫が、孺秤弄驴くのZtnfr12を疯年するために、第び活赋される寥骏におけるZtnfr12の尸邵を疯年するために蝗脱され评る。办忍弄な倘敝步池弄祷恕は、浇尸に澄惟されている∈毋えば、Ponder, ∪Cell Marking Techniques and Their Application.∩in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), pages 115-38 (IRL Press 1987), Coligan at pages 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) at pages 14.6.1 to 14.6.13 (Wiley interscience 1990), and Manson (ed.), Methods In Molecular Biology. Vol. 10: Immunochemical Proteocols (The Humana Press. Inc. 1992) を徊救のこと∷。
≮0394≯
倘敝步池弄浮叫は、栏湿池弄サンプルと钩≥Ztnfr12钩挛とを儡卡し、そして肌に、涟淡栏湿池弄サンプルと、钩挛に冯圭する浮叫できるラベルされた尸灰とを儡卡せしめることによって乖われ评る。毋えば、涟淡浮叫できるラベルされた尸灰は、钩≥Ztnfr12钩挛に冯圭する钩挛喇尸を崔んで喇る。戮数では、钩≥Ztnfr12钩挛は、アビジン/ストレプタビジン∈唆はビオチン∷により儡圭され、そして浮叫できるラベルされた尸灰はビオチン∈唆はアビジン/ストレプタビジン∷を崔むことができる。この答塑弄祷恕の驴くの恃恕は、碰度荚に紊く梦られている。
≮0395≯
戮数では、钩≥Ztnfr12钩挛が、钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛を妨喇するために、浮叫できるラベルにより儡圭され评る。努磊な浮叫できるラベルは、毋えば庶纪栏票疤挛、分各ラベル、步池ルミネセンスラベル、冠燎ラベル、栏湿ルミネセンスラベル唆はコロイド觉垛を蜀崔する。そのような浮叫できるラベルされた倘敝儡圭挛の澜陇第び浮叫数恕は、碰度荚に紊く梦られており、そして布淡により拒嘿に淡很される。
≮0396≯
浮叫できるラベルは、オ〖トラジオグラフィ〖により浮叫される庶纪拉票疤挛であり评る。塑券汤のために泼に铜脱である票疤挛は、3H, 125I, 131I, 35S第び14Cである。
≮0397≯
钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛はまた、分各步圭湿によりラベルされ评る。分各ラブルされた钩挛の赂哼は、努磊な侨墓の各に倘敝儡圭挛を私溪し、そして评られる分各を浮叫することによって疯年される。分各ラベル步圭湿は、フルオレセインイソチオシアネ〖ト、ロ〖ダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o≥フタルアルデヒド第びフルオレサミンを蜀崔する。
≮0398≯
戮数では、钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛は、步圭湿ルミネセンス步圭湿に钩挛步圭湿を儡圭することによって、浮叫弄にラベルされ评る。步池ルミネセンス≥筛急された倘敝儡圭挛の赂哼は、步池瓤炳の粗に栏じるルミネセンスの赂哼を浮叫することによって疯年される。步池ルミネセンスラベリング步圭湿の毋は、ルミノ〖ル、イソルミノ〖ル、帅贯虏アクリジニウムエステル、イミダゾ〖ル、アクリジニウム宾第びオキサレ〖トエステルを蜀崔する。
≮0399≯
票屯に、步池ルミネセンス步圭湿は、塑券汤の钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛をラベルするために蝗脱され评る。栏湿券各は、卡寝タンパク剂が步池ルミネセンス瓤炳の跟唯を光める栏湿池弄システムに斧叫されるタイプの步池ルミネセンスである。栏湿ルミネセンスタンパク剂の赂哼は、ルミネセンスの赂哼を浮叫することによって疯年される。ラベリングのために铜脱である栏湿ルミネセンス步圭湿は、ルシフェリン、ルシフェラ〖ゼ第びエクオリンを蜀崔する。
≮0400≯
戮数では、钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛は、冠燎に钩≥Ztnfr12钩挛步圭湿を儡圭することによって浮叫できるようラベルされ评る。钩≥Ztnfr12≥冠燎儡圭挛が努磊な答剂の赂哼布でインキュベ〖トされる眷圭、冠燎喇尸は、尸各各刨、分各唆は材浑缄檬により浮叫され评る步池喇尸を栏喇するために答剂と瓤炳する。驴くの泼佰弄倘敝儡圭挛を浮叫できるようにラベルするために蝗脱され评る冠燎の毋は、β≥ガラクトシダ〖ゼ、グルコオキシダ〖ゼ、ペルオキシダ〖ゼ第びアルカリホスファタ〖ゼを蜀崔する。
≮0401≯
碰度荚は、塑券汤に骄って蝗脱され评る戮の努磊なラベルを梦っているであろう。钩≥Ztnfr12钩挛へのマ〖カ〖喇尸の冯圭は、碰度肠において梦られている筛洁祷恕を脱いて茫喇され评る。これに簇しての诺房弄な数恕侠は、Kennedyなど., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schursなど., Clim. Acta 81:1 (1977), Shihなど., Int∏l. J. Cancer 46:1101 (1990), steinなど., Cancer Res. 50:1330 (1990), 第びColigan、涟淡により淡很される。
≮0402≯
さらに、倘敝步池弄浮叫の守网さ第び驴屯拉は、アビジン、ストレプタビジン第びビオチンにより儡圭された钩≥Ztnfr12钩挛を脱いることによって笼动され评る∈毋えば、Wilchek. など., (eds.), ∪Avidin-Biotin Technology,∩ Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayerなど., ∪Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,∩ in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.) pages 149-162 (The Humana Press. Inc. 1992) を徊救のこと∷。
≮0403≯
イムノアッセイを乖うための数恕は浇尸に澄惟されている。毋えば、Cook and Self, ∪Monoclonal Antibodies in Diagonostic Immunoassays,∩ in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), Pages 180-208. (Cambridg University Press, 1995), Perry, ∪The Role of Monoclonal antibodies in the Advancement of Immunoassay Technoogy∩, in Monoclonal Antibodies; Principles and applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), and Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996 を徊救のこと。
≮0404≯
塑券汤はまた、Ztnfr12颁帕灰券附についての倘敝池弄壳们アッセイを乖うためのキットも措茶する。そのようなキットは、钩≥Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントを崔んで喇る警なくとも1つの推达を崔んで喇る。キットはまた、Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントの赂哼を绩すことができる1唆は剩眶の活挑を崔んで喇る妈2推达を崔むことができる。そのようなインジケ〖タ〖活挑の毋は、浮叫できるラベル、毋えば庶纪拉ラベル、分各ラベル、步池ルミネセンスラベル、冠燎ラベル、栏湿ルミネセンスラベル、コロイド觉垛第び票屯のものを蜀崔する。
≮0405≯
キットはまた、Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントが、Ztnfr12タンパク剂を浮叫するために蝗脱される、蝗脱荚に帕茫するための缄檬を崔んで喇る。毋えば、矢今の棱汤今は、甚掐される钩挛唆は钩挛フラグメントが、Ztnfr12を浮叫するために蝗脱され评ることを咐第する。矢今の亨瘟は推达に木儡弄に努脱され、唆は矢今の亨瘟は、パッケ〖ジング赁掐挛の妨で捏丁され评る。
≮0406≯
12ˉZtnfr12宠拉を铜するポリペプチドの迹闻弄蝗脱
Ztnfr12宠拉を铜するアミノ焕芹误は、Ztnfr12リガンド∈毋えば、ZTNF4∷を冯圭し、そして骄って、Ztnfr12リガンドの冯圭を柒傍拉Ztnfr12减推挛により烁げることにより、倘敝废を拇泪するために蝗脱され评る。骄って、塑券汤は、Ztnfr12宠拉を铜するタンパク剂、ポリペプチド第びペプチド∈毋えば、Ztnfr12ポリペプチド∈毋えば、Ztnfr12ポリペプチド、Ztnfr12梧击挛∈毋えば、钩≥Ztnfr12钩≥イディオタイプ钩挛∷、第びZtnfr12突圭タンパク剂∷∷の、努磊な翁のZtnfr12ポリペプチドを风いているか、唆は册娟のZTNF4を栏喇する滦据への蝗脱を蜀崔する。
≮0407≯
滦救弄に、Ztnfr12アンタゴニスト∈毋えば、钩≥Ztnfr12钩挛∷が、册娟のZTNF4唆はZtnfr12を栏喇する滦据を借妄するために蝗脱され评る。それらの尸灰は、借妄の涩妥ないずれかの滦据に抨涂され、そして塑券汤は、矫板池弄第びヒト迹闻蝗脱を措茶する。毋绩弄滦据は、赢讫梧滦据、毋えば抢度脱瓢湿、踩密第びヒト吹荚を蜀崔する。ヒト唆はネズミZtnfr12ポリペプチドが、それらの脱庞のために蝗脱され评る。
≮0408≯
Ztnfr12宠拉を铜する尸灰は、极甘倘敝祭吹、B嘿甩粹、倘敝拇泪、IBD第びいずれかの钩挛拆哼拉陕妄池∈毋えば、ITCP、脚旧囤痰蜗旧第び票屯のもの∷、空祭吹、粗儡弄T嘿甩倘敝炳批、败竣室雕冷第び滦缴肩败竣室陕の借妄のために蝗脱され评る。塑券汤ポリペプチドは、倘敝炳批の粗、B嘿甩炳批を泼佰弄に拇泪するために筛弄步され评る。さらに、塑券汤のポリペプチドは、B嘿甩の喇墓、戮の嘿甩の喇墓、钩挛栏喇第びサイトカイン栏喇を拇泪するために蝗脱され评る。塑券汤のポリペプチドはまた、ZTNF4の笼浚跟蔡を面下することによって、T嘿甩第びB嘿甩帕茫を拇泪することができる。
≮0409≯
塑券汤のZtnfr12ポリペプチドは、ZTNF4ポリペプチドの惧竞が簇涂する、プレ≥B唆はB≥嘿甩球缝陕、毋えば缝搦嘿甩球缝陕、她拉唆は缔拉リンパ靛拉球缝陕、裹狂拣、毋えば驴券拉裹狂拣、缝搦嘿甩裹狂拣、柒乳裹狂拣第び叼络嘿甩裹狂拣、第びリンパ拣、毋えば润ホドキンスリンパ拣を借妄するためにZTNF4の跟蔡を面下するために铜脱である。塑汤嘿今に淡很される尸灰により借妄され评るB嘿甩リンパ拣の纳裁の毋は、バ〖キットリンパ拣、润バ〖キットリンパ拣、井甩拉リンパ拣、缔拉リンパ碴靛拉球缝陕、络嘿甩リンパ拣、件收挝拌リンパ拣、蕊遂嘿甩リンパ拣、络嘿甩房リンパ拣∈毋えば、倘敝碴靛拉リンパ拣∷、井リンパ拉リンパ拣、第び戮のB嘿甩リンパ拣を蜀崔する。
≮0410≯
ZTNF4は、CD8+嘿甩、帽靛、践觉仆弹嘿甩、宠拉步された帽靛において券附され、このことは、办年の极甘倘敝祭吹においては、嘿甩魄拉T≥嘿甩がZTNF4の册娟栏喇を奶してB≥嘿甩栏喇を簧枫することを绩す。B≥リンパ靛の侯脱を联买弄に了贿する倘敝娃扩リンパ剂が、祭陕の借妄に蝗脱される。极甘钩挛栏喇は、いくつかの极甘倘敝祭吹に鼎奶し、そして祭陕の寥骏撬蝉第び碍步に大涂する。极甘钩挛はまた、倘敝剩圭挛睦缅圭驶旧の券栏を瞥き、そして链咳拉エリテマト〖デス、毋えば空稍链、坷沸乃旧觉第び秽の驴くの旧觉を瞥く。
≮0411≯
嘿甩炳批に痰簇犯な拇泪钩挛栏喇はまた、驴くの祭陕觉轮において铜弊である。B嘿甩はまた、リウマチ屯簇泪标における簇泪标付拉∈arthritogenic∷倘敝グロブリンの尸如において舔充を遍じることが绩されている。ZTNF4≥簧枫された钩挛栏喇の了巢は、极甘倘敝祭吹、毋えば脚旧囤痰蜗旧第びリウマチ屯簇泪标の借妄において铜弊である。倘敝娃扩恨、毋えばB≥リンパ靛の侯脱を联买弄に了贿するか唆は面下する材拖拉Ztnf12は、そのような誊弄のために铜脱である。
≮0412≯
塑券汤は、极甘倘敝祭吹に簇息するか唆は簇息しない、呵姜檬超空隆祭吹に簇息するB≥嘿甩の侯脱を联买弄に了贿するか唆は面下するためにZtnfr12ポリペプチド、突圭挛、アゴニスト唆はアンタゴニストを蝗脱する数恕を捏丁する。そのような数恕はまた、倘敝池弄空祭吹のためにも铜脱である。そのような数恕は、祭陕、毋えば遂ネフロパシ〖、IgAネフロパシ〖唆はBerger∏s陕に簇息する诲靛挛空标、IgMネフロパシ〖、Goodpasture∏s陕、稿≥炊厉拉诲靛挛空标、诲靛挛粗剂笼浚拉祭吹、她拉リンパ拉球缝陕、腮警恃步ネフロ〖ゼ旧铬凡を借妄するために铜脱である。
≮0413≯
そのような数恕はまた、系犰、驴券拉瓢坍标、Henoch-Schonlein, 古乳旧、HIV≥簇息祭吹、アミロイド旧、唆は拖缝拉洽魄旧铬凡のような祭陕に簇息する企肌诲靛挛空标唆は借妄するための迹闻脱庞として侯脱する。塑券汤の数恕はまた、她拉空獬空标に簇息する拆哼拉空标唆は空獬空标、痰乃拉宛脱、空佬煤、戮の恨により苞き弹こされるネフロパシ〖、空佬旧唆は她拉唆は缔拉拆哼拉空标を借妄するための迹闻脱庞の办婶としても铜脱である。
≮0414≯
塑券汤の数恕はまた、光缝暗拉唆は络缝瓷祭吹、毋えば空瓢坍豆乎唆は誓荷、第びコレステロ〖ル荷莉唆は空荷莉の借妄へのZtnfr12ポリペプチド、突圭挛、钩挛唆はアンタゴニストの蝗脱も蜀崔する。
塑券汤はまた、空唆は如洽达糠栏湿、驴券拉裹狂拣、リンパ拣、L嚎ニュ〖ロパシ〖唆はアミロイド〖シスの借妄のための数恕を捏丁する。
塑券汤はまた、ぜん漏第び戮の她拉丹苹祭吹、毋えば丹瓷毁标第び丹拣の借妄のために、Ztnfr12ポリペプチド、突圭挛、钩挛、アゴニスト唆はアンタゴニストを脱いて、宠拉步されたB嘿甩を了贿し、唆は了巢するための数恕を捏丁する。
≮0415≯
倘敝娃扩への蝗脱のために、泼に滦缴肩拉败竣室陕第び败竣室雕冷に簇してのそのような迹闻蝗脱のために、Ztnfr12ポリペプチド、突圭挛、钩挛、アゴニスト唆はアンタゴニストを脱いて、エフェクタ〖T嘿甩炳批を了巢するか唆は炳批を了巢するか唆は面下するための数恕もまた捏丁される。さらに、Ztnfr12ポリペプチド、突圭挛、钩挛、アゴニスト唆はアンタゴニストは、そのような极甘倘敝祭吹、毋えばインスリン巴赂拉靠拉劈洽陕∈IDDM∷第びクロ〖ン陕の借妄のための迹闻プロトコ〖ルにおいて铜脱である。塑券汤の数恕は、她拉标旧拉祭吹を借妄するために、泼に簇泪乃、拣磨、上缝第び戮の簇息する旧觉を你めるために、第び窃缝拉ショックを借妄するために纳裁の迹闻擦猛を铜する。
≮0416≯
Ztnfr12アゴニストとして票年される步圭湿はまた、挛闭拉倘敝炳批を笼动するためにも铜脱である。B嘿甩炳批は、炊厉拉祭陕、毋えば嘿遁、ウィルス、付栏瓢湿第び大栏拉炊厉の苟封において脚妥である。炊厉拉腮栏湿に滦する钩挛は、钩付に冯圭することによって陕付挛を盖年し、鲁いて输挛拆哼拉拖遁唆は嘿甩拆哼拉苟封を燃なう。Ztnfr12アゴニストは、挛闭拉炳批を笼动するよう侯脱し、そして炊厉拉祭陕唆は倘敝痰松洒觉轮の错副拉の改客のための铜脱な迹闻恨であり、唆はワクチン儡硷へのサプリメントとして铜脱である。
≮0417≯
浇尸に澄惟された瓢湿モデルは、ある祭陕觉轮における塑券汤の材拖拉Ztnfr12ポリペプチドのインビボ跟墙を活赋するために网脱できる。泼に、材拖拉Ztnfr12ポリペプチド第びポリペプチドフラグメントは、极甘倘敝祭吹の驴くの瓢湿モデル、毋えばSLE∈链咳拉エリテマト〖デス∷のモデルとして侯脱する、MRL≥lprllpr唆はNZB∵NZW F1夺蛤废マウス臭においてインビボで活赋され评る。そのような瓢湿モデルは、碰度荚において梦られており、そして毋绩弄モデル、毋えばSLEの极券妨を渴乖するNZBWマウス、悸赋脱アレルギ〖拉蔷涝狂标のためのネズミモデル、コラ〖ゲン投券拉簇泪标ネズミモデル、ネズミ悸赋脱极甘倘敝脚旧囤痰蜗旧、第び票屯のものが惧淡に淡很されている。
≮0418≯
办忍弄に、抨涂されるZtnfr12∈唆はZtnfr12梧击挛唆は突圭タンパク剂∷の脱翁は、吹荚の钳勿、挛脚、咳墓、拉侍、办忍弄な板池弄觉轮第びこれまでの板池弄悟凰のような妥傍に巴赂して恃步するであろう。诺房弄には、腆1pg/kg×10mg/kg∈恨の翁/吹荚の挛脚∷の认跋でのZtnfr12の脱翁∈芒し、それよりも你いか唆は光い脱翁もまた、茨董が回哭する眷圭、抨涂され评る∷を、减推挛に丁惦することが疥司される。
≮0419≯
Ztnfr12ポリペプイドの滦据への抨涂は、渡婶カテ〖テルを奶しての搋萎によるか唆は木儡弄な陕恃柒庙掐による、琅坍柒、瓢坍柒、盛剐柒、囤迄柒、乳布、痘遂柒、句柒抨涂であり评る。庙纪により迹闻脱タンパク剂を抨涂する眷圭、抨涂は息鲁弄庙掐によるか、唆は办搀唆は剩眶搀のボ〖ラスによることができる。
≮0420≯
抨涂の纳裁沸烯は、沸庚、谴遂、琴第び沸乳を蜀崔する。沸庚丁惦は、ポリエステル腮井靛、ゼイン腮井靛、プロテイノイド腮井靛、ポリシアノアクリレ〖ト腮井靛第び婚剂答恨システムのために努磊である∈毋えば、DiBase and Morrel, ∪Oral Delivery of Microencapsulated Protein∩, in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p.255-288 (Plenum Press 1977) を徊救のこと∷。伞剐柒丁惦の悸乖材墙拉は、インスリン抨涂のそのような轮屯により毋绩される∈毋えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1997) を徊救のこと∷。Ztnfr12を崔んで喇る触羚唆は闭挛纬灰は、触羚≥蚀琐尸欢怠、闭挛エ〖ロゾル券栏达唆はネブライザ〖の锦けにより拇澜され、そして帝掐され评る∈毋えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton など., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999) を徊救のこと∷。
≮0421≯
このアプロ〖チは、エ〖ロゾル步されたインスリンを琴に丁惦する排瓢帝掐达であるAERX劈洽陕迹闻システムにより毋绩される。甫垫によれば、48,000kDaほどの络きなタンパク剂が、沸乳抨涂の悸乖材墙拉を毋绩する、你件侨亩不侨の锦けにより迹闻腔刨で乳涉を奶して丁惦されることが绩された∈Mitragotriなど., Science 269: 850 (1995)∷。エレクトロポレ〖ションを脱いての沸乳丁惦は、Ztnfr12宠拉を铜する尸灰を抨涂するもう1つの缄檬を捏丁する∈Pottsなど., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)∷。
≮0422≯
Ztnfr12冯圭宠拉を铜するタンパク剂、ポリペプチド唆はヘプチドを崔んで喇る板挑寥喇湿は、板挑弄に铜脱な寥喇湿を拇澜する贷梦の数恕に骄って芹圭され评、それによれば、迹闻脱タンパク剂が板挑弄に钓推できるキャリヤ〖と鼎に寒圭される。寥喇湿は、その抨涂が减推挛吹荚により钓推され评る眷圭、∪板挑弄に钓推できるキャリヤ〖∩であると咐われる。痰遁リン焕此咀拖闭は、板挑弄に钓推できるキャリヤ〖の1つの毋である。戮の努磊なキャリヤ〖は、碰度荚に紊く梦られている。毋えば、Gennaro (ed.), Remington∏s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) を徊救のこと。
≮0423≯
迹闻のためには、Ztnfr12宠拉を铜する尸灰第び板挑弄に钓推できるキャリヤ〖が、迹闻弄に铜跟な翁で吹荚に抨涂される。Ztnfr12宠拉を铜するタンパク剂、ポリペプチド唆はペプチド、第び板挑弄に钓推できキャリヤ〖の寥み圭わせは、 その抨涂される翁が栏妄池弄に铜罢である眷圭、∪迹闻弄に铜跟な翁∩で抨涂されると咐われる。恨は、その赂哼が减推挛吹荚の栏妄池において浮叫される恃步をもたらす眷圭、栏妄池弄に铜罢である。毋えば、标旧を借妄するために蝗脱される恨は、その赂哼が标旧炳批を此下する眷圭、栏妄池弄に铜罢である。もう1つの毋として、拣徵嘿甩の笼浚を了巢するために蝗脱される恨は、その恨の抨涂が拣徵嘿甩の眶の你布、你められた啪疤、盖妨拣徵のサイズの你布、唆は拣徵の光められた蝉秽をもたらす眷圭、栏妄池弄に铜罢である。
≮0424≯
Ztnfr12∈唆はZtnfr12梧击挛唆は突圭タンパク剂∷を崔んで喇る板挑寥喇湿は、闭挛妨、エ〖ロゾル、唆は盖挛妨で拜积され评る。闭挛妨は、庙纪脱拖闭第び沸庚伏蛮闭により毋绩される。诺房弄な盖挛妨は、カプセル、钧恨第び拇泪された倡庶妨を蜀崔する。稿荚の妨は、ミニ炕譬ポンプ第び败竣挛により毋绩される∈Bremer など., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997): Ranade. ∪Implants in Drug Delivery,∩ in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer など., ∪Protein Delivery with Infusion Pum-s,∩ in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey など., ∪Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,∩ in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), Pages 93-117 (Plenum Press 1997)∷。
≮0425≯
リポソ〖ムは、迹闻脱ポリペプチドを、吹荚に、琅坍柒、盛遂柒、句柒、囤迄柒、乳布、唆は沸庚、帝掐唆は伞剐柒丁惦するための1つの缄檬を捏丁する。リポソ〖ムは、垮拉惰茶を艰り寥む1唆は剩眶の婚剂企霖から喇る腮井ビ〖クルである∈办忍弄には、Bakker Woudenberg など., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim Drugs 46:618 (1993), and Ranade, ∪Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,∩ in Drug Delivery Systems, Ranade and寥栏Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を徊救のこと∷。
≮0426≯
リポソ〖ムは、寥喇において嘿甩遂に梧击し、そして冯蔡として、リポソ〖ムは奥链に抨涂され、そして栏尸豺拉である。拇澜数恕に巴赂して、リポソ〖ムは、帽霖唆は驴霖拉であり评、そしてリポソ〖ムは0.02μm×10μm笆惧の认跋の木仿でサイズ弄に恃步することができる。硷」の恨がリポソ〖ムに甚掐され评る¨谅垮拉恨は企霖に尸充され、そして科垮拉恨は柒婶垮拉鄂粗柒に甚掐される∈毋えば、Macky など., Liposomes In Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987), 第びOstroなど., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989) を徊救のこと∷。さらに、リポソ〖ムサイズ、企霖の眶、婚剂寥喇、第びリポソ〖ムの排操第び山烫拉剂を恃えることにより、甚掐される恨の迹闻网脱拉を拇泪することが材墙である。
≮0427≯
リポソ〖ムは、悸剂弄にいずれかのタイプの嘿甩に帝缅することができ、そして肌に、甚掐された恨をゆっくりと倡庶する。戮数では、帝箭されたリポソ〖ムは、咯嘿甩拉である嘿甩によりエンドサイト≥シス步され评る。エンドサイト≥シスに鲁いて、リポソ〖ム婚剂のリソソ〖ム柒尸豺が燃ない、そして甚掐された恨が倡庶される∈Scherphof など., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)∷。琅坍柒抨涂の稿、井さなリポソ〖ム∈0.1×1.0μm∷は、诺房弄には、次隆第び纾隆に肩として疤弥する讨柒嘿甩废の嘿甩により垒艰されるが、ところが3.0μmよりも络きなリポソ〖ムは琴に睦缅される。讨柒嘿甩废の嘿甩による井さなリポソ〖ムのこの攻ましい垒艰は、マクロファ〖ジ第び次隆の拣徵に步池迹闻恨を丁惦するために蝗脱されて丸た。
≮0428≯
讨柒嘿甩废は、いくつかの数恕、毋えば驴翁のリポソ〖ム纬灰による税下、唆は挑妄池弄缄檬による联买弄マクロファ〖ジ稍宠拉步により搀闰され评る∈Claassenなど., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)∷。さらに、リポソ〖ム遂面への劈婚剂≥唆はポリエチレングリコ〖ル≥投瞥されたリン婚剂の寥み哈みは、讨柒嘿甩废による铜罢に你められた垒艰をもたらすことが绩されている∈Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen など., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)∷。
≮0429≯
リポソ〖ムはまた、リン婚剂寥喇を恃えることによって、唆はリポソ〖ム面に减推挛唆はリガンドを赁掐することによって、泼年の嘿甩唆は达幢を筛弄步するためにも拇澜され评る。毋えば、光い崔铜唯の润イオン拉肠烫宠拉恨により拇澜されたリポソ〖ムが、次隆を筛弄步するために蝗脱されて丸た∈Hayakawaなど., 泣塑泼钓04-244,018规〃Katoなど., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)∷。それらの芹圭湿は、メタノ〖ルにおいて、络痞ホスファチジルコリン、α≥トコフェロ〖ル第びエトキシル步され、垮燎烧裁されたヒマシ听∈HCO≥60∷を寒圭し、涟淡寒圭湿を靠鄂布で腔教し、そして肌に、涟淡寒圭湿を垮により浩菇喇することによって拇澜された。络痞统丸のステリルグルコシド寒圭湿∈SG∷第びコレステロ〖ル∈Ch∷と鼎にジパルミトイルホスファチジルコリン∈DPPC∷のリポソ〖ム芹误湿はまた、次隆を筛弄步することが绩されている∈Shimizuなど., Biol. Pharm. Bull. 20:881∈1997∷∷。
≮0430≯
戮数では、硷」の筛弄步リガンドが、リポソ〖ム、毋えば钩挛、钩挛フラグメント、煤垮步湿、ビタミン第び廷流タンパク剂の山烫に冯圭され评る。毋えば、リポソ〖ムは、次隆嘿甩の山烫惧で迫狸弄に券附されるアシアログリコプロテイン∈ガラクト〖ス∷减推挛筛弄步するために、晦尸かれ房のガラクトシル婚剂投瞥挛により恃拉され评る∈Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)∷。票屯に、Wuなど., Hepatology 27: 772 (1988) は、アジアロフェチュインによるリポソ〖ムのラベリングが没くされたリポソ〖ム冯窘染负袋を瞥き、そしてアジアロフェチュイン≥ラベルされたリポソ〖ムの次嘿甩による垒艰を润撅に光めたことを绩している。
≮0431≯
戮数では、晦尸かれ房のガラクトシル婚剂投瞥挛を崔んで喇るリポソ〖ムの次隆眠姥が、アジアロフェチュインの涟庙掐により了巢され评る∈Murahashiなど., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)∷。ポリアコニチル步されたヒト缝蓝アルブミンリポソ〖ムは、次隆嘿甩へのリポソ〖ムの筛弄步のためのもう1つのアプロ〖チを捏丁する∈Kamps など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)∷。さらに、Gehoなど., (アメリカ泼钓妈4,603,044规)は、次隆の泼检步された洛颊嘿甩に簇息する次美瓷减推挛に滦する泼佰拉を铜する、次嘿甩≥回哭されたリポソ〖ム井甩丁惦システムを淡很する。さらに、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸は、Ztnfr12券附嘿甩、毋えばB嘿甩弹富の拣徵嘿甩にリポソ〖ムを数羹づけるために蝗脱され评る。
≮0432≯
寥骏筛弄步へのより办忍弄なアプロ〖チにおいては、筛弄嘿甩は、筛弄嘿甩により券附されるリガンドに滦して泼佰弄な、ビオチニル步された钩挛によりプレラベルされる∈Harasymなど., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)∷。头违钩挛の缝搦怯近の稿、ストレプタビジン≥儡圭されたリポソ〖ムが抨涂される。もう1つのアプロ〖チにおいては、筛弄步钩挛は、リポソ〖ムに木儡弄に冯圭される∈Harasymなど., Adv. Drug. Deliv. Rev. 32: 99 (1998)∷。
≮0433≯
Ztnfr12宠拉を铜するポリペプチドは、タンパク剂のマイクロカプセル甚掐の筛洁祷恕を脱いて、リポソ〖ム柒に甚掐され评る∈毋えばAndersonなど., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Andersonなど., Cancer Res. 50: 1853 (1990), and Cobenなど., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving など., ∪Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies,∩ in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993), Wassef など., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)を徊救のこと∷。惧淡に绩されるように、迹闻弄に铜脱なリポソ〖ムは、硷」の喇尸を崔むことができる。毋えば、リポソ〖ムは、ポリ∈エチレングリコ〖ル∷の婚剂投瞥挛を崔むことができる∈Allenなど., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)∷。
≮0434≯
尸豺拉ポリマ〖腮井靛が、迹闻脱タンパク剂の光い链咳レベルを拜积するため措茶された。腮井靛は、尸豺拉ポリマ〖、毋えばポリ∈ラクチド≥コ≥グリコリド∷∈PLG∷、ポリ痰垮湿、ポリ∈オルトエステル∷、モノ栏尸豺拉エチルビニルアセテ〖トポリマ〖∈タンパク剂がポリマ〖甚掐される∷から拇澜されるGombotz and Pettit, Bioconugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, ∪Role of Polymers in Drug Delivery.∩ In Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, ∪Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,∩ in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus など., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコ〖ル∈PEG∷蕊胜された亩腮井靛はまた、迹闻脱タンパク剂の琅坍柒抨涂のためのキャリヤ〖を捏丁することができる∈毋えば、Grefなど., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997) を徊救のこと∷。
≮0435≯
塑券汤はまた、惧淡で侠じられたように、ポリペプチドがポリマ〖により冯圭されている、Ztnfr12宠拉を铜する步池弄に恃拉されたポリペプチド第びZtnfr12アンタゴニストを措茶する。さらに、塑券汤は、惧淡で侠じられるように、キャリヤ〖、Ztnfr12ポリペプチド、第びBCMAポリペプチド第びTACIポリペプチドの警なくとも1つを崔んで喇る寥喇湿、毋えば板挑寥喇湿に簇する。
≮0436≯
戮の脱翁妨は、毋えば、Anset and Popovich. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington∏s Pharmaceutical sciences. 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) により、第びRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) により绩されるように、碰度荚により雇捌され评る。
≮0437≯
毋绩のように、板挑寥喇湿は、Ztnfr12嘿甩嘲ドメイン唆はZtnfr12アンタゴニスト∈毋えば、Ztnfr12ポリペプチドを冯圭する钩挛唆は钩挛フラグメント∷と鼎に1つのポリペプチドを崔んで喇る推达を崔んで喇るキットとして丁惦され评る。迹闻脱ポリペプチドは、帽办唆は剩眶搀の脱翁のための庙纪脱拖闭の妨で、唆は庙纪の涟、浩菇喇されるであろう痰遁蚀琐として丁惦され评る。戮数では、そのようなキットは、迹闻脱ポリペプチドの抨涂のための触羚蚀琐尸欢怠、闭挛エ〖ロゾル券栏怠唆はネブライザ〖を蜀崔することができる。そのようなキットはさらに、板挑寥喇湿の回绩第び蝗脱恕に滦する矢今での攫鼠を蜀崔する。さらに、そのような攫鼠は、Ztnfr12寥喇湿が、Ztnfr12に滦する贷梦の册梢拉を铜する吹荚に敦戴を绩される捏绩も蜀崔することができる。
≮0438≯
13ˉZtnfr12ヌクレオチド芹误の迹闻弄蝗脱
塑券汤は、Ztnfr12を、そのような借妄の涩妥な滦据に丁惦するためへのZtnfr12ヌクレオチド芹误の蝗脱を蜀崔する。Ztnfr12宠拉の笼动は、倘敝娃扩祭吹の借妄の办婶として铜脱であリ评る。さらに、Ztnfr12颁帕灰券附を了巢する迹闻脱券附ベクタ〖、毋えばアンチセンス尸灰、リボザイム唆は嘲婶捌柒芹误尸灰が丁惦され评る。ZTNF4宠拉の了巢は、ZTNF4を冯圭せず、唆はZTNF4との冯圭に鲁いてシグナルを栏喇しない∈毋えば、Ztnfr12嘿甩柒ドメインにおける仆脸恃佰のために∷Ztnfr12减推挛の妨をコ〖ドする券附ベクタ〖を瞥掐することによって茫喇され评る。踩密迹闻脱庞唆はヒト迹闻脱庞に簇しては、そのような乘焕尸灰は、惧淡で侠じられるように、俱巢唆は祭陕を铜する滦据に抨涂され评る。惧淡で侠じられた1つの毋として、Ztnfr12≥倘敝グロブリン突圭タンパク剂をコ〖ドする乘焕尸灰は、链咳拉エリトマト〖デスの墓袋迹闻のために蝗脱され评る。
≮0439≯
Ztnfr12を券附する寥垂え缴肩嘿甩の蝗脱、Ztnfr12をコ〖ドする顽の乘焕の丁惦、Ztnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰と鼎にカチオン拉婚剂キャリヤ〖の蝗脱、第びZtnfr12を券附するウィルス、毋えば寥垂えレトロウィルス、寥垂えアデノ≥簇息ウィルス、寥垂えアデノウィルス、第び寥垂えヘルペス帽姐ウィルス∈HSV∷の蝗脱を蜀崔する、Ztnfr12颁帕灰を滦据に瞥掐するための驴くのアプロ〖チが赂哼する∈毋えば、Mulligan, Science 260: 926 (1993), Rosenberg など., Science 242: 1575 (1988), LaSalle など., Science 250: 988 (1993), Wolffなど., Science 247: 1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3: 203 (1991) を徊救のこと∷。エクスビボアプロ〖チにおいては、嘿甩が滦据から帽违され、Ztnfr12颁帕灰を券附するベクタ〖によりトランスフェクトされ、そして肌に、滦据面に败竣される。
≮0440≯
Ztnfr12颁帕灰の券附をもたらすために、Ztnfr12颁帕灰をコ〖ドするヌクレオチド芹误が、颁帕灰啪继を扩告するために、コアプロモ〖タ〖第び扦罢には、拇泪妥燎に侯脱材墙に息冯される券附ベクタ〖が菇喇される。券附ベクタ〖の办忍弄な涩妥拉は、惧淡に淡很されている。
≮0441≯
戮数では、Ztnfr12颁帕灰は、寥垂えウィルスベクタ〖、毋えばアデノウィルスベクタ〖∈毋えば、Kass-Eister など., Proc. Nat∏l Acad. Sci. USA 90: 11498 (1993), Kolis など., proc. Nat∏l Acad. Sci. USA 91: 215 (1994), Liなど., Hum. Gene Ther. 4;403 (1993), Vincent など., Nat. Genet. 5:130 (1993), and Zabner など., Cell 75: 207 (1993)∷、アデノウィルス≥簇息ウィルスベクタ〖∈Flotteなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613 (1993)∷、アルファウィルス、毋えば∪Semliki Forest ウィルス第びSindbisウィルス∈Hertz and Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju and Huang, J.vir. 65:2501 (1991), 第びXiongなど., Science 243: 1188 (1989)∷、ヘルペスウィルスベクタ〖∈Koeringなど., Hum. Gene. Therap. 5: 457 (1994)∷、
≮0442≯
ポックスウィルスベクタ〖∈Ozakiなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 653 (1993), Panicali and Paoietti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927 (1982)∷、ポックスウィルス、毋えばカナリヤポックスウィルス唆はワクシニアウィルス∈Fisher-Hochなど., Proc. Hatl. Acad. Sci. USA 86: 317 (1989) 第びFlexner など., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86 (1989)∷、第びレトロウィルス∈Baba など., J. Neurosurg 79: 729 (1993), Ram など., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiyaなど., J. Neurosci. Res. 33: 493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860 (1993) 第びAndersonなど., アメリカ泼钓妈5,399,346规∷を脱いて丁惦され评る。硷」の轮屯においては、ウィルスベクタ〖极挛唆はウィルスベクタ〖を崔むウィルス纬灰のいずれかが、布淡に淡很される数恕第び寥喇湿に蝗脱され评る。
≮0443≯
1つシステムの毋绩として、アデノウィルス、すなわち企塑嚎DNAウィルスは、佰硷乘焕尸灰の丁惦のための浇尸に泼魔づけられた颁帕灰トランスファ〖ベクタ〖である∈Beckerなど., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)∷。アデノウィルスシステムは、肌のいくつかの网爬を捏丁する¨∈i∷孺秤弄络きなDNA赁掐挛を箭推する墙蜗、∈ii∷光い蜗擦に笼浚する墙蜗、∈iii∷弓认跋の赢讫梧嘿甩房を炊厉する墙蜗、第び∈iV∷驴くの佰なったプロモ〖タ〖、毋えば首哼拉で、寥骏泼佰弄な、第び拇泪できるプロモ〖タ〖と鼎に蝗脱される墙蜗。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが缝萎において奥年しているので、琅坍柒庙纪により抨涂され评る。
≮0444≯
アデノウィルスゲノムの办婶が风己されているアデノウィルスベクタ〖を脱いて、赁掐挛は、木儡弄な息冯により、唆は票箕トランスフェクトされたプラスミドによる陵票寥垂えにより、ウィルスDNA面に寥み哈まれる。诺房弄なシステムにおいては、涩寇E1颁帕灰がウィルスベクタ〖から风己され、そしてウィルスは、E1颁帕灰が缴肩嘿甩により丁惦されない眷圭、剩澜しないであろう。禄なわれていない瓢湿に琅坍柒丁惦される眷圭、アデノウィルスは肩に、次隆を筛弄步する。E1颁帕灰风己を铜するアデノウィルス丁惦システムが缴肩嘿甩において剩澜しない眷圭、缴肩の寥骏は、コ〖ドされた佰硷タンパク剂を券附し、そしてプロセッシングするであろう。缴肩嘿甩はまた、その滦炳する颁帕灰が尸如シグナル芹误を崔む眷圭、佰硷タンパク剂を尸如するであろう。尸如されたタンパク剂は、佰硷颁帕灰を券附する寥骏∈毋えば、光く缝瓷步された次隆∷から桔茨に刊掐するであろう。
≮0445≯
さらに、ウィルス颁帕灰の硷」の风己を崔むアデノウィルスベクタ〖は、そのベクタ〖に滦する倘敝炳批を你めるか唆は怯近するために蝗脱され评る。そのようなアデノウィルスは、E1≥风己され、そしてさらに、E2A唆はE4の风己を崔む∈Luskyなど., J. Virol. 72: 2022 (1998); Raper など., Human Gene Therapy 9: 671 (1998)∷。E2bの风己はまた、倘敝炳批を你めることが鼠桂されている∈Amalfitanoなど., J. Virol. 72:926 (1998)∷。窗链なアデノウィルスゲノムを风己することによって、佰硷DNAの润撅に络きな赁掐挛が箭推され评る。すべてのウィルス颁帕灰が风己されている、いわゆる∪稍宠拉∈gutless∷∩アデノウィルスの栏喇は、佰硷DNAの络きな赁掐挛の赁掐のために泼に攻旁圭である∈Yeh and Perricaudet, FASEB J. 11: 615 (1997) を徊救のこと∷。
≮0446≯
迹闻脱颁帕灰を券附できる寥垂えウィルスの光い蜗擦のストックが、筛洁数恕を脱いて、炊厉された赢讫梧嘿甩から评られる。毋えば、寥垂えHSVは、Vero嘿甩において、Brandtなど., J. Gen. Virol. 72: 2043 (1991), Herold など., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grauなど., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 30: 2474 (1989), Brandiなど., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), 第びBrawn and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Human Press 1997) により淡很のようにして、拇澜され评る。
≮0447≯
戮数では、Ztnfr12颁帕灰を崔んで喇る券附ベクタ〖は、リポソ〖ムを脱いてのインビボリポフェクションにより、滦据の嘿甩に瞥掐され评る。圭喇カチオン婚剂が、マ〖カ〖をコ〖ドする颁帕灰のインビボトランスフェクションのためのリポソ〖ムを拇澜するために蝗脱され评る∈Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 第びMackey など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988∷。インビボで泼年の达幢面に嘲傍颁帕灰を瞥掐するためへのリポフェクションの蝗脱は、办年の悸狠弄な网爬を铜する。泼年嘿甩房へのトランスフェクションの数羹づけが、嘿甩佰剂拉を铜する寥骏、毋えば绻隆、次隆、空隆第び蔷において泼に攻旁圭であることは汤球である。婚剂は、筛弄步のために戮の尸灰に步池弄に评られる。筛弄步されたペプチド∈毋えば、ホルモン唆は坷沸帕茫湿剂∷、タンパク剂、毋えば钩挛唆は润ペプチド尸灰は、步池弄にリポソ〖ムに冯圭され评る。
≮0448≯
エレクトロポレ〖ションは、抨涂のもう1つの轮屯である。毋えば、Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16: 867 (1998) は、囤迄面への颁帕灰トランスファ〖のためへのインビボエレクトロポレ〖ションの蝗脱を绩している。
颁帕灰闻恕へのもう1つのアプロ〖チにおいては、迹闻脱颁帕灰は、Ztnfr12の券附を了巢するZtnfr12アンチセンスRNAをコ〖ドすることができる。アンチセンス尸灰のための努磊な芹误は、塑汤嘿今に倡绩されるZtnfr12のヌクレオチド芹误から投瞥され评る。
≮0449≯
戮数では、拇泪妥燎がリボザイムをコ〖ドするヌクレオチド芹误に侯脱材墙に息冯される券附ベクタ〖が菇喇され评る。リボザイムは、mRNA尸灰における办年の筛弄芹误に羹けられるエンドヌクレア〖ゼ宠拉を券附するよう措茶され评る∈毋えば、Draper and Macejak, アメリカ泼钓妈5,496,698规、McSwiggen, アメリカ泼钓妈5,525,468规、Chowrira and McSwiggen, アメリカ泼钓妈5,631,369规第びRobertson and Goldberg, アメリカ泼钓妈5,225,337规を徊救のこと∷。塑券汤においては、リボザイムはZtnfr12 mRNAと冯圭するヌクレオチド芹误を蜀崔する。
≮0450≯
もう1つのアプロ〖チにおいては、拇泪妥燎がZtnfr12颁帕灰をコ〖ドするmRNA尸灰のRNア〖ゼP≥拆哼拉磊们を楼渴できるRNA啪继挛の栏喇を数羹づける券附ベクタ〖が菇喇され评る。このアプロ〖チによれば、嘲婶捌柒芹误が、嘿甩リボザイムにより鲁いて磊们される、泼年硷の嘿甩柒mRNAに柒傍拉リボザイム、すなわちRNア〖ゼPを羹けるために菇喇され评る∈毋えば、Altmanなど., アメリカ泼钓妈5,168,053规、Yuanなど., Science 263: 1269 (1994), Paceなど., WO96/18733规、Georgeなど., WO96/21731规第びWemerなど., WO97/33991规を徊救のこと∷。毋えば、涟淡嘲婶捌柒芹误は、Ztnfr12 mRNAに滦して陵输弄な10×15改のヌクレオチド芹误、第び3∏≥NCCAヌクレオチド芹误∈ここで、Nは攻ましくはプリンである∷を崔んで喇る。嘲婶捌柒芹误啪继挛は、mRNAと陵输弄嘲婶捌柒芹误との粗での宾答滦の妨喇により、筛弄步されたmRNA硷に冯圭し、骄って、涟淡宾答滦圭された挝拌の5∏娄に疤弥するヌクレオチドでのRNア〖ゼPによるmRNAの磊们を楼渴する。
≮0451≯
办忍弄に、Ztnfr12ヌクレオチド焕芹误を铜する迹闻脱ベクタ〖、毋えば寥垂えウィルスを崔んで喇る寥喇湿の脱翁は、滦救の钳勿、挛脚、咳墓、拉侍、办忍弄な板池弄觉轮第びこれまでの板池弄悟凰のような妥傍に巴赂して恃步するであろう。迹闻脱ベクタ〖の努磊な抨涂沸烯は、琅坍柒庙纪、瓢坍柒庙纪、盛剐柒庙纪、囤迄柒庙纪、拣徵柒庙纪、第び拣徵を崔む剐面への庙纪を蜀崔する。毋绩のように、Hortonなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1553 (1999)は、インタ〖フェロン≥αをコ〖ドするプラスミドDNAの囤迄柒庙纪がネズミモデルにおいて办肌第び啪败拉拣徵に滦する材墙拉ある钩拣徵跟蔡を栏喇することを绩す。
≮0452≯
塑券汤のウィルスベクタ〖、润ウィルスベクタ〖唆はウィルス第び润ウィルスベクタ〖の寥み圭わせを崔んで喇る寥喇湿は、板挑弄に铜脱な寥喇湿を拇澜するための贷梦数恕に骄って芹圭され评、それによれば、ベクタ〖唆はウィルスは、板挑弄に钓推できるキャリヤ〖と鼎に寒圭される。惧淡で绩されるように、寥喇湿、毋えばリン焕此咀拖闭は、その抨涂が减推挛滦据により钓推され评る眷圭、∪板挑弄に钓推できるキャリヤ〖∩であると咐われる。戮の努磊なキャリヤ〖は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Remington∏s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), 第びGilman∏s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) を徊救のこと∷。
≮0453≯
迹闻のためには、迹闻脱颁帕灰ベクタ〖、唆はそのようなベクタ〖を崔んで喇る寥垂えウィルス、第び板挑弄に钓推できるキャリヤ〖が、迹闻弄铜跟翁で滦据に抨涂され评る。券附ベクタ〖∈唆はウィルス∷第び板挑弄に钓推できるキャリヤ〖の寥み圭わせは、抨涂される翁が栏妄池弄に铜罢である眷圭、∪迹闻弄铜跟翁∩で抨涂されると咐われる。恨は、その赂哼が减推挛滦据の栏妄池において浮叫できる恃步をもたらす眷圭、栏妄池弄に铜罢である。毋えば、标旧を借妄するために蝗脱される恨は、その赂哼が标旧炳批を此下する眷圭、栏妄池弄に铜罢である。もう1つの毋として、拣徵嘿甩の笼浚を了巢するために蝗脱される恨は、その恨の抨涂が拣徵嘿甩の眶の你布、你められた啪败、盖妨拣徵のサイズの你布、唆は拣徵の你められた蝉秽をもたらす眷圭、栏妄池弄に铜罢である。
≮0454≯
迹闻脱颁帕灰券附ベクタ〖唆は寥垂えウィルスにより借妄される滦据がヒトである眷圭、迹闻は攻ましくは、挛嘿甩颁帕灰迹闻である。すなわち、迹闻脱颁帕灰券附ベクタ〖唆は寥垂えウィルスによるヒトの攻ましい借妄は、ヒト栏浚嘿甩废の办婶を妨喇し、そして肌の坤洛に奶され评る乘焕尸灰を嘿甩面に瞥掐すること∈すなわち、ヒト栏浚废颁帕灰迹闻∷を涩妥としない。
≮0455≯
14ˉ迹闻弄に铜脱な倘敝儡圭挛
塑券汤は、惧淡で侠じられたように、顽钩≥Ztnfr12钩挛∈唆はその顽钩挛フラグメント∷の蝗脱、第び硷」の祭陕、毋えばB≥嘿甩碍拉祭吹の借妄をもたらすためへの倘敝儡圭挛の蝗脱に簇する。倘敝儡圭挛は、筛洁祷恕を脱いて拇澜され评る。毋えば、倘敝儡圭挛は、钩挛喇尸に迹闻恨を粗儡弄に儡圭することによって栏喇され评る∈毋えば、Shihなど., Int. J. Cancer41: 832-839 (1988); Shihなど., Int. J. Cancer 46: 1101-1106 (1990); 第びShihなど., アメリカ泼钓妈5,057,313规を徊救のこと。
≮0456≯
缄没には、1つの筛洁アプロ〖チは、焕步された煤垮步湿婶尸を铜する钩挛喇尸と、警なくとも1つの头违アミン怠墙を铜し、そして驴くの挑恨、トキシン、キレ〖ト步恨、怙燎烧裁湿唆は戮の迹闻亨を砷操されているキャリヤ〖ポリマ〖とを瓤炳せしめることを蜀崔する。この瓤炳は、呵姜儡圭挛を妨喇するために妈企アミンへの丛傅により奥年步され评る介袋シェフ宾答∈イミン∷息冯をもたらす。
≮0457≯
涟淡キャリヤ〖ポリマ〖は、戮の悸剂弄に票霹のポリマ〖キャリヤ〖がまた蝗脱され评るが、警なくとも50改のアミノ焕荒答のアミノデキストラン唆はポリペプチドであり评る。攻ましくは、呵姜倘敝儡圭挛は、抨涂の推白拉第び迹闻への蝗脱のためへの跟蔡弄筛弄步のために、垮拖闭、第び赢讫梧缝蓝に材拖拉である。骄って、キャリヤ〖ポリマ〖惧の奥年步幢墙答は、呵姜倘敝儡圭挛の缝蓝拖豺を笼动するであろう。
≮0458≯
ポリペプチド迹闻恨を崔んで喇る倘敝儡圭挛を栏喇するための戮のアプロ〖チにおいては、迹闻恨は、グルタアルデヒド教圭により、唆はポリペプチド惧の宠拉步されたカルボキシ答とアミノデキストラン惧のアミンとの瓤炳によりアミノデキストランに冯圭される。キレ〖ト步恨は、庶纪拉垛掳唆は姬丹鼎棠エンハンサ〖を崔んで喇る倘敝儡圭を拇澜するために钩挛喇尸に冯圭され评る。毋绩弄キレ〖ト步恨は、エチレンジアミン煌枯焕第びジエチレントリアミン皋枯焕の投瞥挛を蜀崔する。怙燎烧裁湿、毋えばカルボランは骄丸の数恕により钩挛喇尸に冯圭され评る。
≮0459≯
倘敝儡圭挛はまた、迹闻恨と钩挛喇尸とを木儡弄に儡圭することによって拇澜され评る。その办忍弄数恕は、粗儡弄儡圭数恕に梧击し、芒し迹闻恨は焕步された钩挛喇尸に木儡弄に冯圭されている。
≮0460≯
さらなる毋绩として、迹闻恨は、ジスルフィド冯圭妨喇を奶して、丛傅された钩挛尸尸のヒンジ挝拌で冯圭され评る。毋えば、テタヌストキシンペプチドは、钩挛喇尸にペプチドを冯圭するために蝗脱される帽办のシステイン荒答により菇喇され评る。戮の缄檬として、そのようなペプチドは、ヘテロ企幢墙擦餐抖恨、毋えばN≥スクシニル3≥∈2≥ピリジルジチオ∷プロピオ〖ネ〖トを脱いて、钩挛喇尸に冯圭され评る。
≮0461≯
そのような儡圭についての办忍弄祷恕は、碰度肠において梦られている。毋えば、Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacisなど., ∪ Modification of Antibodies by Chemical Methods∩ in Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Birchなど. (eds.), pages187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, ∪Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies∩ in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterなど., (eds.), Pages 60-84 (Cambridge University Press 1995) を徊救のこと。
≮0462≯
惧淡のように、钩挛のFc挝拌における煤垮步湿喇尸は、迹闻恨を儡圭するために蝗脱され评る。しかしながら、Fc挝拌は、钩挛フラグメントが倘敝儡圭挛の钩挛喇尸として蝗脱され评る眷圭、稍哼である。それにもかかわらず、钩挛唆は钩挛フラグメントのL嚎材恃挝拌面に煤垮步湿喇尸を瞥掐することが材墙である。毋えば、Leungなど., J. Immunol. 154: 5919 (1996); Hansen など., アメリカ泼钓妈5,443,953规∈1995∷を徊救のこと。肌に、菇蜜された煤垮步湿喇尸が、迹闻恨を冯圭するために蝗脱される。
≮0463≯
さらに、碰度荚は、儡圭数恕の驴くの材墙拉ある恃恕を千急するであろう。毋えば、煤垮步湿喇尸は、缝闭、リンパ唆は戮の嘿甩嘲萎挛における禄なわれていない钩挛唆はその钩付≥冯圭フラグメントの染负袋を橙磨するために、ポリエチレングリコ〖ルを冯圭するために蝗脱され评る。さらに、煤垮步湿喇尸唆は头违スルフヒドリル答に迹闻恨を冯圭することによって、企擦の倘敝儡圭挛を菇喇することが材墙である。そのような头违スルフヒドリル答は、钩挛喇尸のヒンジ挝拌に疤弥することができる。
≮0464≯
1つのタイプの倘敝儡圭挛は钩挛喇尸第びポリペプチド嘿甩魄燎を崔んで喇る。努磊なポリペプチド嘿甩魄燎の毋は、リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂である。I房リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は办塑嚎タンパク剂であり、そしてII房リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、ジスルフィド冯圭により息冯される润票办のサブユニット∈A第びB嚎∷から喇る∈浩雇のためには、Soriaなど., Targeted Diagn. Ther. 7: 193 (1992) を徊救のこと∷。
≮0465≯
铜脱なI房リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、肌のものを蜀崔する¨サポナリアˇオフィシナリス∈Saponaria officinalis∷(毋えば、サポリン≥1、サポリン≥2、サポリン≥3、サポリン≥6)、モモルジカˇカランチア∈Momordica charantia∷(毋えば、モモルジン)、ビロニアˇジオイカ∈Byronia dioica∷(毋えば、ブリオジン、ブリオジン≥2)、トリコサンテスˇキリロウイ∈Trichosanthes kirilowii∷(毋えば、トリコサンチン、トリコキリン)、ゲロニウムˇムルチフロラム∈Gelonium multiflorum∷(毋えば、ゲロニン)、フィトロカˇアメリカナ∈Phytolacca americana∷(毋えば、ヤマゴボウ钩ウィルスタンパク剂、アマゴボウ钩ウィルスタンパク剂≥II、钩ウィルスタンパク剂)、第び票屯のものからのポリペプチド。リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、毋えばアメリカ泼钓5,635,386规∈Walshなど.,∷により淡很される。
≮0466≯
努磊なII房リボソ〖ム稍宠拉タンパク剂は、リシナスˇコムニス∈Ricinus communis∷(毋えば、リシン)、アブラスˇプレカトリウム∈Abrus precatorius∷(毋えば、アブリン)、アデニアˇディジタタ∈Adenia digitata∷∈毋えば、モデシン∷、第び票屯のものからのポリペプチドを蜀崔する。II房リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、ガラクトシドを冯圭するB嚎、第びアデンソインを爵步する魄拉A嚎を蜀崔するので、II房リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂儡圭挛はA嚎を蜀崔するべきである。
≮0467≯
纳裁の铜脱なリボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、ボウガニン∈bouganin∷、クラビン、トウモロコシリボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂、バカリアˇピラミダタ∈Vaccaria pyramidata∷リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂、ニグリンb, 宾答拉ニグリン1、エブリン、ラセモシンb、ルフィン≥a、ルフィン≥b、ルフィン≥S第び碰度荚に梦られている戮のリボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂を蜀崔する。
≮0468≯
毋えば、Bolognesi and Stripeによる柜狠给倡戎规WO98/55623规、Colnaghiなどによる柜狠叫搓戎规WO97/49726规、Heyなどによるアメリカ泼钓妈5,635,384规、Bolognesi and Stripeによる柜狠给倡戎规WO95/07297规、Ariasなどによる柜狠给倡戎规WO94/20540规、Watanabeなど., J. Biochem. 106: 6977 (1989); Islam など., Agric. Biol. Chem. 55: 229 (1991), 第びGaoなど., FEBS Lett. 347: 257 (1994) を徊救のこと。
≮0469≯
欧脸に赂哼するリボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂はまた、塑汤嘿今に淡很される筛弄步寥喇湿のためにも努磊であり、そしてそのようなタンパク剂は碰度荚に梦られている。リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂は、给弄に掐缄できるアミノ焕第びヌクレオチド芹误を脱いて栏喇され评る。毋绩のように、サポリン≥6をコ〖ドするヌクレオチド芹误は、Lorenzettiなど., アメリカ泼钓妈5,529,932规により倡绩され、そしてWalshなど., アメリカ泼钓妈5,635,384规は、トウモロコシ第び络渠リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂ヌクレオチド第びアミノ焕芹误を淡很する。さらに、リボソ〖ム稍宠拉步タンパク剂はまた辉任されている。
≮0470≯
纳裁のポリペプチド嘿甩魄燎は、リボヌクレア〖ゼ、DNア〖ゼI、ブドウ靛遁エンテロトキシン≥A、ジフテリア魄燎、シュ〖ドモナスエキソトキシン第びシュ〖ドモナスエンドトキシンを蜀崔する。毋えば、Pastanなど., Cell 47: 641 (1986), 第びGoldenberg, CA A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994) を徊救のこと。戮の努磊なトキシンは、碰度荚に梦られている。
≮0471≯
もう1つの办忍弄なタイプの铜脱な嘿甩魄燎は、チロシンキナ〖ゼインヒビタ〖である。チロシンキナ〖ゼによる笼浚の宠拉步は拣徵の渴乖第び沸册において舔充を遍じることが绩されているので、この宠拉步は、チロシンキナ〖ゼインヒビタ〖を丁惦するZtnfr12钩挛喇尸により了巢され评る。努磊なチロシンキナ〖ゼインヒビタ〖は、イソフラボン、毋えばゲニステイン∈5, 7, 4∏≥トリヒドロキシイソフラボン∷、ダイゼン∈7, 4∏≥ジヒドロキシイソフラボン∷第びビオカニンA∈4≥メトキシゲニステイン∷第び票屯のものを蜀崔する。喇墓傍灰にチロシンインヒビタ〖を儡圭する数恕は、毋えばアメリカ泼钓妈5,911,995规∈Uckun∷により淡很される。
≮0472≯
もう1つのグル〖プの铜脱なポリペプチド嘿甩魄燎は、倘敝モジュレ〖タ〖を蜀崔する。塑汤嘿今に蝗脱される眷圭、∪倘敝モジュレ〖タ〖∩とは、サイトカイン、创嘿甩喇墓傍灰、リンフォトキシン、票箕簧枫尸灰、陇缝傍灰第び票屯のもの、事びにそれらの尸灰の圭喇梧击挛を蜀崔する。倘敝モジュレ〖タ〖の毋は、蝉秽傍灰、インタ〖ロイキン∈毋えば、インタ〖ロイキン≥1∈IL≥1∷、IL≥2×IL≥21∷、コロニ〖簧枫傍灰∈毋えば、瘗纬靛≥コロニ〖簧枫傍灰第び瘗纬靛マクロファ〖ジ≥コロニ〖簧枫傍灰∷、インタ〖フェロン∈毋えば、インタ〖フェロン≥α、≥β、≥γ、≥ω第び≥τ∷、∪S1傍灰∩と疚する创嘿甩喇墓傍灰、エリトロポエチン第びトロンボポエチンを蜀崔する。毋绩弄な倘敝モジュレ〖タ〖喇尸は、IL≥2、IL≥6、IL≥10、インタ〖フェロン≥γ、TNF≥α第び票屯のものを蜀崔する。
≮0473≯
倘敝モジュレ〖タ〖を崔む倘敝儡圭挛は、倘敝モジュレ〖タ〖を筛弄嘿甩に丁惦するための缄檬を捏丁し、そして拣徵嘿甩に滦して泼に铜脱である。倘敝モジュレ〖タ〖の嘿甩魄拉跟蔡は、碰度荚に紊く梦られている。毋えば、Klegermanなど、∪Lymphokines and Monokines∩, in Biotechnology and pharmacy, Pessutoなど. (eds.), pages 53-70 (Chapman & Hall 1993) を徊救のこと。毋绩のように、インタ〖フェロンは、硷」の嘿甩の山烫惧でのクラスI寥骏努圭拉钩付の光められた券附を投券することによって嘿甩笼浚を了巢し、そして骄って、嘿甩魄拉Tリンパ靛による嘿甩の撬蝉庐刨を笼动する。さらに、拣徵蝉秽傍灰、毋えば拣徵蝉秽傍灰≥αは、DNA们室步を投券することによって、嘿甩魄拉跟蔡を栏喇すると蛔われる。
≮0474≯
塑券汤はまた、嘿甩魄燎をコ〖ドする乘焕尸灰を崔んで喇る倘敝儡圭挛を蜀崔する。このアプロ〖チの毋として、Hogansonなど., Human Gene Ther. 9: 2565 (1998) は、サポリン颁帕灰を崔んで喇る券附ベクタ〖により教圭されたFGF≥2≥ポリリシン儡圭挛を栏喇することによって、サポリン颁帕灰のFGF≥2拆哼拉丁惦を淡很する。
戮の努磊な魄燎は、碰度荚に梦られている。
≮0475≯
嘿甩魄拉ポリペプチド第び钩挛喇尸の儡圭挛は、ポリペプチドを儡圭するための筛洁の祷恕を脱いて拇澜され评る。毋えば、Lam and Kelleher, アメリカ泼钓妈5,055,291规は、ジフテリア魄燎フラグメントA唆はリシン魄燎のいずれかにより儡圭される钩挛の栏喇を淡很する。办忍弄なアプロ〖チはまた、Lappiなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 917 (1989), Soria など., Targeted Diagn. Ther. 7: 193 (1992), Buechlerなど., Eur. J. Biochem. 234: 706 (1995), Behar-Cohenなど., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36: 2434 (1995), Lappi and Baird, アメリカ泼钓妈5,191,067规、Calabresiなど.,アメリカ泼钓妈5,478,804规、第びLappi and Baird, アメリカ泼钓妈5,576,288规により淡很されるように、サポリンによる俐拜碴嘿甩喇墓傍灰の儡圭数恕により毋绩される。
≮0476≯
また、Ghetie and Vitteta, ∪Chemical Construction of Immunotoxin∩, in Drug Targetting: Strategies, Principles, and Applications, Francis and Delgado (Eds.), pages 1-26 (Humana Press, Inc. 2000), Hall (Ed.), Immunotoxin Methods and Protocols (Humana Press, Inc. 2000), 第びNewton and Rybak, ∪Construction of Ribonuclease-Antibody Conjugates for Selective Cytotoxicity∩, in Drug Targeting: Strategies, principles and Applications, Francis and Delgade (Eds.), pages 27-35 (Humana Press, Inc. 2000) を徊救のこと。
≮0477≯
办数では、钩挛喇尸第び嘿甩魄燎ポリペプチドを崔んで喇る突圭タンパク剂は、筛洁の数恕を脱いて栏喇され评る。嘿甩魄燎ポリペプチド喇尸を崔んで喇る突圭タンパク剂を拇澜するための数恕は、钩挛≥魄燎突圭タンパク剂栏喇の度肠において紊く梦られている。毋えば、インタ〖ロイキン≥2喇尸を崔んで喇る钩挛突圭タンパク剂は、Boletiなど., Ann. Oncol. 6: 945 (1995), Nicoletなど., Cancer Gene Ther. 2: 161 (1995), Beckerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7826 (1996), Hankなど., Clin. Cancer Res. 2: 1951 (1996), 第びHuなど., Cancer Res. 56: 4998 (1996) により淡很されている。さらに、Yangなど., Hum. Antibodies Hybridomas 6: 129 (1995) は、F(ab∏)2 フラグメント第び拣徵蝉秽傍灰≥α喇尸を崔む突圭タンパク剂を淡很する。
≮0478≯
钩挛≥シュ≥ドモナスエキソトキシンA突圭タンパク剂は、Chaudharyなど., Nature 339¨394∈1989∷、Brinkmannなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8616 (1991), Batraなど., proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5867 (1992), Friedmanなど., J. Immunol. 150: 3054 (1993), Wels など., Int. J. Can. 60: 137 (1995), Fominayaなど., J. Biol. Chem. 271: 10560 (1996), Kuan など., Biochemistry 35: 2872 (1996), 第びSchmidtなど., Int. J. Can. 65: 538 (1996) により淡很されている。
≮0479≯
ジフテリア魄燎喇尸を崔む钩挛≥魄燎突圭タンパク剂は、Kreitmanなど., keukemia 7: 553 (1993), Michollsなど., J. Biol. Chem. 268: 5302 (1993), Thompsonなど., J. Biol. Chem. 270: 28038 (1995), 第びValleraなど., Blood 88: 2342 (1996) により淡很されている。Deonarainなど., Tumor Targetting 1: 177 (1995) はRNア〖ゼ喇尸を铜する钩挛≥魄燎突圭タンパク剂を淡很しており、そしてLinardouなど., Cell Biophys. 24-25: 243 (1994) は、DNア〖ゼI喇尸を崔んで喇る钩挛≥魄燎突圭タンパク剂を栏喇した。
≮0480≯
ゲロニンは、Betterなど., J. Biol. Chem. 270: 14951 (1995) の钩挛≥魄燎突圭タンパク剂における魄燎喇尸として蝗脱された。さらなる毋として、Dohlstenなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8945 (1994) は、ブドウ靛遁エンテロトキシン≥Aを崔んで喇る钩挛≥魄燎突圭タンパク剂を鼠桂している。また、Newton and Rybak, ∪Preparation of Recombinant Rnase Sigle-Chain Antibody Fusion Proteins∩, in Drug Targeting: Strategies, Principles, and Applications, Francis and Delgado (Eds.), pages 77-95 (Humana press, Inc. 2000) を徊救のこと。
≮0481≯
ポリペプチド嘿甩魄拉に洛わるものとして、倘敝儡圭挛は、嘿甩魄燎喇尸として庶纪拉票疤挛を崔むことができる。毋えば、倘敝儡圭挛は、钩≥Ztnfr12喇尸第びα≥庶纪拉票疤挛、β≥庶纪拉票疤挛、γ≥庶纪拉票疤挛、Auger排灰エミッタ〖、α≥纬灰を庶纪する面拉灰梳惩恨、第び排灰瘦割により束蝉する庶纪拉票疤挛を崔むことができる。努磊な庶纪拉票疤挛は肌のものを蜀崔する¨198Au, 199Au, 32P, 33P, 125I, 131I, 123I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 211At, 47Sc, 103Pb, 109Pd, 212Pb, 71Ge, 77As, 105Rh, 113Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193MPt, 197Hg第び票屯のもの。
≮0482≯
庶纪拉票疤挛は、钩挛喇尸に、キレ〖ト步恨を奶して木儡弄に、唆は粗儡弄に儡圭され评る。毋えば、β≥纬灰第びγ≥俐を丁惦する庶纪拉票疤挛であると蛔われる67Cuは、キレ〖ト步恨、すなわちp≥ブロモアセトアミド≥ベンジル≥テトラエチルアミノ煌枯焕を脱いて、钩挛喇尸に儡圭され评る。∈Chase and Shapiro, ∪Medical Applications of Radioisotopes∩, in gennaro (ed.), Remington∏s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, p. 943-865 (Mack Publishing Company 1995)∷。
≮0483≯
戮のものとして、エネルギッシュなβ≥纬灰を庶纪する90Yはジエチレントリアミン皋枯焕を脱いて、钩挛喇尸に冯圭され评る。さらに、131Iによる钩挛喇尸の木儡弄な庶纪拉ラベリングのための诺房弄な努磊な数恕は、Steinなど., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 703 (1991) により淡很される。戮数では、怙燎藕裁湿、毋えばカルボランが、筛洁祷恕を脱いて、钩挛喇尸に冯圭され评る。
≮0484≯
倘敝儡圭挛の拇澜のためのもう1つの房の努磊な嘿甩魄燎は、步池闻恕挑湿である。毋绩弄な步池闻恕挑湿は、免燎マスタ〖ド、アルキルスルホネ〖ト、ニトロソウレア、トリアゼン、驼焕梧击挛、ピリミジン梧击挛、プリン梧击挛、钩栏湿剂、エピポドフィロトキシン、球垛芹疤壶挛、第び票屯のものを蜀崔する。步池闻恕挑湿の泼年の毋は、メトトレキサ〖ト、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シス≥プラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、メルファラン、クロラムブシル、マイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサノ〖ル第び票屯のものを蜀崔する。努磊な步池闻恕恨は、Remington∏s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mark Publishing Co. 1995), 第びGoodman and gilman∏s The Pharmacological basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985) に淡很される。戮の努磊な步池迹闻恨は、碰度荚に梦られている。
≮0485≯
もう1つのアプロ〖チにおいては、倘敝儡圭挛は、钩挛喇尸に各宠拉恨唆は咖燎を儡圭することにより拇澜される。分各第び戮の咖付挛、唆は毋えば材浑各に滦して梢炊なポルフィリンは、陕恃に滦して努磊な各を羹けることによって、陕恃を浮叫し、そして借妄するために蝗脱されて丸た。このタイプの∪各庶纪俐∩、∪各迹闻∩唆は∪各蜗池∩闻恕は、毋えばMewなど., J. Immunol. 130; 1473 (1983), Joriなど. (eds.), Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto 1985), oseroffなど., proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8744 (1986), van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1988), Hasanなど., prog. Clin. Biol. Res. 288: 471(1989), Tatsutaなど., Lasers Surg. Med. 9: 422 (1989), 第びPelegrinなど., Cancer 67: 2529 (1991) により淡很される。
≮0486≯
迹闻のために蝗脱される倘敝儡圭挛は、板挑弄に钓推できる垮拖拉ポリマ〖喇尸を崔んで喇ることができる。そのようなポリマ〖を冯圭するための数恕は、碰度荚に梦られており、そしてそれまで淡很されて丸た。
惧淡アプロ〖チはまた、倘敝儡圭挛を崔んで喇る驴泼佰弄钩挛寥喇湿を拇澜するためにも蝗脱され评る。ポリペプチド嘿甩魄燎はまた、钩挛喇尸への儡圭の涟唆は稿、惧淡数恕を脱いて、努磊なポリマ〖により儡圭され评る。材拖拉ポリマ〖はまた、钩挛突圭タンパク剂により儡圭され评る。
≮0487≯
办忍弄に、钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛は、Ztnfr12ポリペプチドの迹闻蝗脱に簇して涟で侠じられたようにして抨涂され评る。顽钩≥Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントは、倘敝儡圭挛唆は钩挛突圭タンパク剂抨涂により输郊され评る。1つの恃恕においては、顽钩≥Ztnfr12钩挛∈唆は顽钩挛フラグメント∷は、你脱翁の庶纪拉ラベルされた钩≥Ztnfr12钩挛唆は钩挛フラグメントと鼎に抨涂される。妈2の恃恕として、顽钩≥Ztnfr12钩挛∈唆は钩挛フラグメント∷は、你脱翁の庶纪拉ラベルされた钩≥Ztnfr12钩挛≥サイトカイン倘敝儡圭挛と鼎に抨涂される。
≮0488≯
妈3の恃恕として、顽钩≥Ztnfr12钩挛∈唆は钩挛フラグメント∷は、庶纪拉ラベルされていない钩≥Ztnfr12≥サイトカイン倘敝儡圭挛と鼎に抨涂される。∪你脱翁∩の131I≥ラベルされた倘敝儡圭挛に簇しては、攻ましい脱翁は、15×40mCiであり、そして呵も攻ましい认跋は20×30mCiである。滦救弄に、攻ましい脱翁の90Y≥ラベルされた倘敝儡圭挛は10×30mCiであり、そして呵も攻ましい认跋は10×20mCiである。票屯に、企泼佰弄钩挛喇尸は、倘敝儡圭挛唆は钩挛突圭タンパク剂抨涂により输郊される。
≮0489≯
钱面拉灰宠拉步迹闻のための怙燎藕裁された≥砷操キャリヤ〖を铜する倘敝儡圭挛は奶撅、梧击する缄檬でもたらされるであろう。しかしながら、面拉灰救纪が乖われる涟、筛弄步されていない倘敝儡圭挛がクリアランスになるまで略つことが攻旁圭である。クリアランスは、倘敝儡圭挛に冯圭する钩挛を脱いて楼渴され评る。この办忍弄付妄の淡很については、アメリカ泼钓妈4,624,846规を徊救のこと。
≮0490≯
塑券汤はまた、倘敝モジュレ〖タ〖が、赖撅嘿甩第び泼に陇缝嘿甩の庶纪俐≥投券された、唆は挑恨≥投券された魄拉を烁げるか、败瓢せしめるか唆は嫡啪するために抨涂される借妄数恕にも簇する。烧裁弄倘敝モジュレ〖タ〖闻恕は、减推挛赢讫梧の光められた卵拉のために、より光い脱翁の嘿甩魄拉恨の抨涂を材墙にする。さらに、烧裁弄倘敝モジュレ〖タ〖闻恕は、脱翁扩嘎の裹狂魄拉を烁げるか、汾负するか唆は嫡啪することができる。烧裁弄闻恕のための努磊な倘敝モジュレ〖タ〖の毋は、瘗纬靛≥コロニ〖簧枫傍灰、瘗纬靛マクロファ〖ジ≥コロニ〖簧枫傍灰、トロンボポイエチン、IL≥1、IL≥3、IL≥12第び票屯のものを蜀崔する。烧裁弄倘敝モジュレ〖タ〖迹闻数恕は、アメリカ泼钓妈5,120,525规∈Goldenberg∷により倡绩される。
≮0491≯
钩≥Ztnfr12钩挛第び倘敝儡圭挛は、Ztnfr12ポリペプチド第びZtnfr12突圭タンパク剂の删擦について惧淡に淡很される、インビトロアプロ〖チ第び瓢湿モデルを脱いて活赋され评る。
≮0492≯
钩≥Ztnfr12钩挛闻恕の跟墙は、塑汤嘿今に淡很される倘敝儡圭挛第び戮の妨の输郊闻恕により顽钩挛喇尸を输郊することによって笼动され评る。そのような驴屯レジメにおいては、输郊迹闻寥喇湿は、顽钩≥Ztnfr12钩挛の抨涂の涟、それと票屯に唆はその稿、抨涂され评る。塑券汤の驴屯拉闻恕はさらに、钩≥Ztnfr12倘敝儡圭挛の抨涂により输郊される输钩≥Ztnfr12钩挛喇尸による倘敝迹闻を蜀崔する。もう1つの妨の驴屯拉迹闻においては、滦据は、顽钩≥Ztnfr12钩挛第び筛洁の粹步池闻恕を减ける。
≮0493≯
板挑寥喇湿は、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸唆は企泼佰弄钩挛喇尸を崔んで喇る推达を崔んで喇るキットとして丁惦され评る。迹闻尸灰は、帽办唆は剩眶搀脱翁のための庙纪脱拖闭の妨で、唆は庙纪の涟、浩菇喇される痰遁蚀琐として捏丁され评る。戮数では、そのようなキットは、钩≥Ztnfr12钩挛喇尸の抨涂のための触羚≥蚀琐尸欢达、闭挛エアロゾル券栏达唆はネブライザ〖を蜀崔することができる。そのようなキットはさらに、板挑寥喇湿の山绩第び蝗脱恕についての矢鞠攫鼠を崔んで喇る。さらに、そのような攫鼠は、涟淡寥喇湿が嘲傍拉钩挛に滦して贷梦の册梢拉を铜する吹荚において敦戴を绩される咐汤を蜀崔することができる。
≮0494≯
15ˉトランスジェニックマウスの栏喇
トランスジェニックマウスは、すべての寥骏において、唆は寥骏≥泼佰弄唆は寥骏に攻ましい拇泪妥燎の扩告布で、Ztnfr12颁帕灰を册娟券附するよう菇蜜され评る。Ztnfr12のそれらの册娟栏喇挛は、册娟券附に弹傍する山附房を泼魔づけるために蝗脱され评、そしてトランスジェニック瓢湿は册娟Ztnfr12により苞き弹こされるヒト祭陕のためのモデルとして侯脱することができる。Ztnfr12を册娟券附するトランスジェニックマウスはまた、络きな瓢湿の讫搅唆は缝闭におけるZtnfr12、毋えば材拖拉Ztnfr12の栏喇のためのモデル栏湿瓤炳挛を捏丁する。
≮0495≯
トランスジェニックマウスを栏喇するための数恕は、碰度荚に紊く梦られている∈毋えば、Jacob, ∪Expression and Knockout of interferons in Transgenic Mice,∩ in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), and Abbud and Nilson, ∪Recombinant Protein Expression in Transgeic Mice,∩ in Gen Expression Systems: using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)を徊救のこと∷。
≮0496≯
毋えば、Ztnfr12颁帕灰を券附するトランスジェニックマウスを栏喇するための数恕は、喇较した减篮墙秃∈硷マウス∷∈B6C3f1, 栏稿2≥8ヶ奉∈Tacomic Farms, Germantown, NY∷∷、篮瓷磊近された秃∈duds∷(B6D2f1, 2≥8ヶ奉(Taconic Farms∷)、 蛔秸袋木涟减论墙惑∈ドナ〖∷∈B6C3f1, 4-5降∈Taconic Farms∷∷、第び喇较した减论墙惑∈减推挛∷∈B6D2f1, 2≥4ヶ奉∈taconic farms∷∷により倡幌することができる。ドナ〖は、1降粗、丹铬界炳步され、そして肌に、腆8IU/マウスのPregnant Mare∏s Serum ゴナドトロピン∈Sigma Chemical Company, St. Louis, MO∷I.P. により、第び46≥47箕粗稿、8IU/マウスのヒトChorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)) L.P. により庙纪され、册娟怯婉を投券された。ドナ〖が、ホルモン庙纪に鲁いて、硷マウスにより蛤芹される。怯婉は办忍弄に、hCG庙纪の13箕粗笆柒に栏じる。蛤儡は、蛤芹の肌の墨、绱莉の赂哼により澄千される。
≮0497≯
减篮された婉を缄窖脱スコ〖プ布で礁める。婉瓷を礁め、そして婉を、ヒアルロニダ〖ゼ∈Sigma∷を崔む洽浮汉脱スライド面に倡庶する。婉を、1刨、アヒルロニダ〖ゼにより丽爵し、そして2刨、Whitten∏s W640 寝挛∈Menino and O∏cloray, Biol. Reprod. 77: 159 (1986), 第びDienhart and Downs, Zygote 4: 129 (1996) により淡很される∷により丽爵し、これを5◇CO2、5◇O2第び90◇N2と鼎に37☆でインキュベ〖トする。肌に、婉を、マイクロインジェクションまで、37☆/5◇CO2のインキュベ〖タ〖に鸣垄する。
≮0498≯
Ztnfr12コ〖ド芹误を崔むプラスミドDNA10×12μgを、俐觉步し、ゲル篮澜し、そしてマイクロインジェクションのために5≥10ng/μlの呵姜腔刨で、10mMのトリス≥HCl (pH7.4), 0.25mMのEDTA∈pH8.0∷の拖闭に浩伏蛮する。毋えば、Ztnfr12コ〖ド芹误は、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥69、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥79唆は芹误戎规13のアミノ焕荒答1≥69をコ〖ドすることができる。
≮0499≯
プラスミドDNAを、萌かな、CO2士拐步された观听により蕊胜された1刨のW640寝挛に崔まれる、箭诚された婉面にマイクロインジェクトする。DNAを庙纪脱克面に帝い哈み∈0.75mmのID, 1mmのOD怙肪焕宾ガラス嘿瓷から苞き却かれる∷、そして改」の婉面に庙掐する。庙纪脱克により、改」の婉の、ハプロイド涟乘の1つ唆は尉荚面に从奶する。
眶ピコリットルのDNAを涟乘面に庙掐し、そして庙纪脱克を、乘と儡卡しないよう苞き却く。涟淡数恕を、すべての婉が庙掐されるまで、瓤牲する。旁圭紊くマイクロインジェクトされた婉を、涟もってガス却きされたW640寝挛を铜する达幢寥骏≥禽蛙划面に败し、37☆/5◇CO2のインキュベ〖タ〖において办日、鸣垄する。
≮0500≯
肌の泣、2嘿甩の骢を、刀钎勘减推挛面に败す。减推挛は、篮瓷磊近されたdudsとの蛤儡の稿、绱莉の赂哼により票年される。减推挛に算快をし、そして秦烫焊娄惧の逃を逆り、そして缄窖脱覆腮独に败す。磊倡を、乳涉において、第び痘吃、秦婶第び稿涤により车维される盛婶の面丙、すなわち扫と纾隆との粗の面庞まで囤迄噬を奶して乖う。栏浚达幢を、井さな缄窖脱ドレ〖プ惧に磊近する。婚嗣パッドを、缄窖脱ドレ〖プ惧に弓げ、そして灰丁脱贿缝井铋灰∈Roboz, Rockville, MD∷を、婚嗣パットに艰り烧け、そしてマウスの秦婶惧をつるし、达幢が盛婶にスライドすることを松ぐ。
≮0501≯
观听、鲁いて蛤高にW640第び鄂丹丹刷を崔む篮躬なトランスファ〖ピペットにより、涟泣の庙掐からの12×17改の夫汞な2≥嘿甩骢を、减推挛面に败す。四磨した四络婶を疤弥疯年し、そしてその四络婶と蜀との粗の婉瓷を瘦积し、婉瓷の癸み誊を涟淡蜀に钨儡して、28gの克により乖い、四络婶唆は蜀を析かないことを澄かめる。
≮0502≯
ピペットを、婉瓷における癸み誊に败し、そして骢を酷き哈み、呵介の鄂丹丹刷のピペットからの近殿を材墙にする。婚嗣パッドを汾く、盛遂面に病し哈み、そして栏浚达幢を酬り哈ませる。盛遂噬を、1つの衰圭により誓じ、そして乳涉を烬庚脱クリップにより誓じる。マウスは、警なくとも4箕粗、37☆の萌かなスライド惧で搀牲した。
≮0503≯
减推挛を、滦でカゴに提し、そして19≥21泣の钎勘を材墙にする。寐栏稿、19≥21泣の缓稿を、违讫の涟に材墙にする。违讫灰丁の拉侍を凑侍し、そして侍」の拉侍のカゴに掐れ、そして0.5cmの栏浮∈颁帕灰房急侍のために蝗脱される∷を、萨から、痰遁のハサミにより艰る。
≮0504≯
ゲノムDNAを、QIAGEN DNEASYキットを脱いて、その澜陇度荚の棱汤今に骄って、磊り艰られた萨から拇澜する。ゲノムDNAを、票じプラスミドに瞥掐されたZtnfr12颁帕灰唆は联买マ〖カ〖颁帕灰を笼升するために措茶されたプライマ〖を脱いて、PCRにより尸老する。瓢湿がトランスジェニックであることが澄かめられた稿、それらは、トランスジェニック惑を填栏房秃と鼎に、唆はトランスジェニック秃を1唆は剩眶の填栏房惑と鼎に芹弥することによって、夺蛤废に提し蛤花する。灰丁が栏まれ、そして违讫され、拉侍を尸け、そしてそれらの萨を、颁帕灰房急侍のために磊り艰る。
≮0505≯
栏赂瓢湿におけるトランスジ〖ンの券附について拇べるために、婶尸次磊近を乖う。缄窖洁洒を、zyphoid供镍布で木儡弄に惧婶盛婶に乖う。痰遁祷恕を脱いて、井さな1.5≥2cmの磊倡を、痘裹布で乖い、そして次隆の焊娄驼を艰り叫す。4≥0辅诲を脱いて、布婶驼を挛剐嘲に澄瘦するために、その布婶驼の搀りを躯る。クランプを脱いて、その冯び誊を瘦积し、そして帝箭拉Dexon (American Cyanamid; Wayne, N. J.) の妈2ル〖プを、呵介の冯び誊に钨儡して芹弥する。斌疤磊们をDexon冯び誊から乖い、そして腆100mgの磊近された次隆寥骏を、痰遁ペトリ划に芹弥する。
≮0506≯
磊近された次隆磊室を、14mlのポリプロピレン摧撵瓷に败し、そして闭挛免燎において培冯し、そして肌に、ドライアイス惧に鸣垄する。缄窖婶疤を、衰圭第び烬庚脱クリップにより誓じ、そして瓢湿のカゴを、37☆で裁钱されるパッド惧に、缄窖の稿、24箕粗、芹弥する。瓢湿を缄窖の稿、髓泣拇べ、そして烬庚脱クリップを、缄窖の7≥10泣稿に艰り近く。Ztnfr12 mRNAの券附レベルを、RNA拖闭ハイブリダイゼ〖ションアッセイ唆はポリメラ〖ゼ嚎瓤炳を脱いて、改」のトランスジェニックマウスについて活赋する。
≮0507≯
Ztnfr12を册娟券附するトランスジェニックマウスを栏喇する戮に、その颁帕灰を佰撅に你く券附するか、唆はまったく券附しないトランスジェニックマウスを菇蜜することは铜脱である。そのようなトランスジェニックマウスは、Ztnfr12の风己に簇息する祭陕のための铜脱なモデルを捏丁する。惧淡で侠じられたように、Ztnfr12颁帕灰券附は、アンチセンス颁帕灰、リボザイム颁帕灰、唆は嘲婶捌柒芹误颁帕灰を脱いて了巢され评る。Ztnfr12颁帕灰を册警券附するトランスジェニックマウスを栏喇するためには、そのような了巢芹误がZtnfr12 mRNAに筛弄步される。泼年の颁帕灰の佰撅に你い券附をトランスジェニックマウスを栏喇するための数恕は、碰度荚に梦られている∈毋えば、Wuなど., ∪Gene Under Expression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and DNA Strategies∩ in Methods in Gene Biotechnology, p. 205-224 (CRC Press 1997) を徊救のこと∷。
≮0508≯
Ztnfr12颁帕灰券附をほとんどか唆はまったく铜さないトランスジェニックマウスを栏喇するための戮のアプロ〖チは、润幢墙拉Ztnfr12颁帕灰により弥垂された、警なくとも1つの赖撅Ztnfr12滦惟颁帕灰を铜するマウスを栏喇することである。润幢墙拉Ztnfr12颁帕灰を措茶する1つの数恕は、もう1つの颁帕灰、毋えば联买マ〖カ〖颁帕灰を、Ztnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰柒に赁掐することである。いわゆるそれらの∪ノックアウトマウス∩を栏喇するための筛洁の数恕は、碰度荚に梦られている∈毋えば、Jacob, ∪Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,∩ in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994), 第びWuなど., ∪New Strategies for Gene Knockout,∩ in Methods in Gene Biotechnology, Pages 339-365 (CRC Press 1997)を徊救のこと∷。
≮0509≯
办忍弄に淡很されて丸た塑券汤は、肌ぎの毋により推白に妄豺されるであろう。芒し、それらの毋は、塑券汤を扩嘎するものではない。
≮悸卉毋≯
≮0510≯
毋1ˉZtnfr12をコ〖ドする乘焕尸灰の帽违
この甫垫は、∪Reh∩∈ATCC No. CRL-8286∷と疚するヒトB≥リンパ涟额挛嘿甩废を蝗脱した。cDNAライブラリ〖を、Reh嘿甩から拇澜し、そして16改の96≥ウェルプレ〖トを脱いてアッセイした。改」のウェルは、腆250改のEˉコリコロニ〖を崔み、そして改」のコロニ〖は、1つのcDNAクロ〖ンを崔む。DNA miniprepsを、Qiaprep 96 Turboキット∈Qiagen, Inc, ; Valencia, CA∷を脱いて、96≥ウェル妨で拇澜した。肌に、DNAを、それぞれ3000改のクロ〖ンを山した128のプ〖ルに尸けた。それらのプ〖ルを、12≥ウェルプレ〖トにおけるCOS≥7嘿甩にトランスフェクトし、そして哇拉プ〖ルを、嘿甩≥山烫ZTNF4冯圭により疯年した。
≮0511≯
COS嘿甩トランスフェクションを肌の奶りにして乖った。5μlのプ〖ルされたDNA∈腆0.5≥1.0μg∷第び5μlのリポフェクタミンを、92μlの缝蓝フリ〖DMEM禽孟∈500mgのDMEM面、55mgのピルビン焕ナトリウム、146mgのL≥グルタミン、5mgのトランスフェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレニウム第び5mgのフェチュイン∷において寒圭し、技补で30尸粗インキュベ〖トし、そして肌に、400μlの缝蓝フリ〖DMEM禽孟を藕裁した。この寒圭湿500μlを、12≥ウェルのフィブリネクチン≥涟借妄された寥骏禽蛙プレ〖ト惧にプレ〖トされた1.5∵105改の嘿甩/ウェルに藕裁し、そして嘿甩を37☆で5箕粗インキュベ〖トした。肌に、500μlの20◇FBS DMEM禽孟∈500mlのDMEM面、100mlのFBS、55mgのピルビン焕ナトリウム第び146mgのL≥グルタミン∷を、ウェル碰たりに藕裁し、そして嘿甩を办日インキュベ〖トした。
≮0512≯
嘿甩山烫冯圭アッセイを、肌の奶りにして、ビオチニル步されたFLAG≥筛急されたZTNF4を脱いて乖った。禽孟を、1◇BSA/PBSにより嘿甩からすすぎ、そして嘿甩を、TNB∈垮面、0.1Mのトリス≥HCl、0.15MのNaCl第び0.5◇ブロッキング活挑≥NEN Renaissance TSA-Direct Kit Cat # NEL701∷により1箕粗ブロックした。肌に、嘿甩を、TNB面、3μg/mlのビオチニル步されたFLAG≥筛急されたZTNF4と鼎に1箕粗インキュベ〖トした。嘿甩を、1◇BSA/PBSにより丽爵し、そして肌に、TNB面、1¨300に歹坚されたストレプタビジン≥HPP∈NENキット∷と鼎にさらに1箕粗インキュベ〖トした。
≮0513≯
嘿甩を1◇BSA/PBSにより丽爵し、そして肌に、PBS面、1.8◇ホルムアルデヒドにより15尸粗、盖年した。肌に、嘿甩を、TNT∈垮面、0.1Mのトリス≥HCl、0.15MのNaCl、第び0.05◇のTween≥20∷により丽爵した。冯圭を、歹坚此咀闭により1¨50に歹坚されたフルオレセインチラミド活挑と鼎に4×5尸粗、嘿甩をインキュベ〖トすることによって浮叫した∈NENキット∷。嘿甩をTNTにより丽爵し、そしてTNTにより1¨5に歹坚されたVECTASHIELD Mounting Media (Vector Labs; Burlingame, CA) により瘦赂した。嘿甩を、分各覆腮独惧でFITCフィルタ〖を脱いて材浑步した。
≮0514≯
1つの哇拉DNAプ〖ル、すなわち∪10A11∩と、惧淡数恕を脱いて票年した。プ〖ル10A11のDNAを、EˉコリDH10B面にエレクトロポレ〖トし、そしてコロニ〖をフィルタ〖により积ち惧げ、そして丽爵した。Eˉコリから帽违されたDNAを、COS面にトランスフェクトし、そして哇拉プ〖ルDNA∪4D∩を、ZTNF4冯圭アッセイを脱いて票年した。プ〖ル4Dのコロニ〖を、96≥ウェル面にトランスファ〖し、そしてDNAを、Qiaprep96Turboキットを脱いて帽违した。哇拉クロ〖ン4D2H≥6を惧淡数恕を脱いて票年した。ZTNF4冯圭の泼佰拉を活赋するために、4D2H≥6クロ〖ンDNAを、COS嘿甩面にトランスファ〖し、そしてZTNF4第びZTNF2の冯圭を活赋した。ZTNF4は4D2H≥6 DNAによりトランスフェクトされたCOS嘿甩に冯圭するが、ZTNF2は涟淡嘿甩と冯圭しなかった。滦救弄に、ZTNF4第びZTNF2の尉荚は、TACI DNAによりトランスフェクトされたCOS嘿甩に冯圭した。
≮0515≯
毋2ˉヒト第びネズミ寥骏におけるZtnfr12颁帕灰券附
ノザンブロット尸老を、Human Multiple Tissue Blots (MTN I, MTN II第びMTN III) (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, Ca), Human Immuno System ブロット∈CLONTECH∷、Human赖撅mRNAブロット∈Invitrogen, San Diego, Ca∷第びHuman Fetal Multiple Tissue Blots (CLONTECH) を脱いて乖った。570宾答滦ヒトプロ〖ブを、肌の瓤炳掘凤布で、オリゴヌクレオチド37550∈5∏GCGAATTCGTCGGCACCATGAGGCGAGGG3∏∷∈芹误戎规10∷第び37549∈5∏CGCTCGAGCTGCCGGCTCCCTGCTATTGTTG3∏∷∈芹误戎规11∷によるPCRにより栏喇した¨94☆で2尸〃94☆で30擅、60☆で30擅、72☆で30擅∈35サイクル∷〃鲁いて、72☆で5尸。
≮0516≯
PCRフラグメントを、QIAQUICKゲル藐叫キット∈QIAGEN, Inc. ; Santa Clarita, Ca∷を脱いて、ゲル篮澜した。プロ〖ブを、REDIPRIME II DNA Labeling システム∈AMERSHAM, Inc.; UK∷を脱いて、澜陇度荚の惮呈に骄って、32Pにより庶纪拉ラベルした。プロ〖ブを、NUCTRAPプッシュカラム∈Stratagene; La Jolla, Ca∷を脱いて篮澜した。EXPRESSHYB∈CLONTECH∷拖闭を、ブロットのためのハイブリダイズ拖闭のために蝗脱した。ハイブリダイゼ〖ションは65☆で办日で栏じた。
≮0517≯
肌に、ブロットを、技补で2∵SCC第び0.05◇SDSにより4刨、鲁いて、50☆で0.1∵SSC第び0.1◇SDSにより2刨、丽爵した。1つの啪继挛サイズを、腆4.4kbで浮叫した。
≮0518≯
拣徵ブロットをまた、ヒト灰弟拣徵ブロット∈Invitrogen, San Diego, Ca∷、ヒト拣徵パネルブロット4第び5∈Invitrogen Gorporation; San Diego, Ca∷、ヒトリンパブロット∈Invitrogen∷、ヒト粹嘿甩废ブロット∈CLONTECH∷第びヒト球缝陕ブロットにより活赋した。ドットブロットをまた、Human Multiple Tissue Expression Blot (CLONTECH) 第びHuman Cancer Gene Screening Blot (Biochain Institute, Inc.; Hayward, Ca) を脱いて尸老した。ドットブロット尸老のための数恕第び掘凤は、惧淡に倡绩される剩眶寥骏ブロットについてと票じであった。
≮0519≯
Ztnfr12颁帕灰券附を、纾隆、リンパ泪、琐究缝闭リンパ靛、空隆、看隆、次隆、裹呈囤、绻隆、甥空、篮零、蔷、灰弟、斑、裹狂、丹瓷毁、痘粒、论茸、论基次隆第びRaji嘿甩において囱弧した。呵动のシグナルは、纾隆寥骏、リンパ泪寥骏第び琐究缝闭に簇息された。
≮0520≯
毋3ˉ嘿甩废におけるZtnfr12颁帕灰券附
TAQMAN RT-PCR (Applied Biosystems; Foster City, CA) を脱いて、Ztnfr12颁帕灰、第びTACI第びBCMA颁帕灰の券附をさらに活赋した。それらの甫垫においては、柒傍拉ヒトβ≥グルクロニダ〖ゼ唆はグリセルアルデヒド≥3≥リン焕デヒドロゲナ〖ゼの券附を、滦救として蝗脱した。Ztnfr12、TACI第びBCMA RNAレベルを、それらの滦救颁帕灰のRNAレベルに滦して孺秤した。
≮0521≯
山6に绩されるように、その冯蔡は、Ztnfr12が肩にB废嘿甩惧で迫狸弄に券附されることを绩した。泼に、Ztnfr12颁帕灰券附を、妨剂啪垂されたBリンパ拣嘿甩废、毋えばBurkitt∏s リンパ拣统丸の嘿甩∈毋えば、RAMOS嘿甩、DAUDI嘿甩、RAJI嘿甩、BJAB嘿甩、第びHS Sultan嘿甩∷、润Hodgkin∏s リンパ拣统丸の嘿甩∈RL嘿甩∷、B≥嘿甩リンパ碴靛拉球缝陕嘿甩∈IM9, SUP-B15第びREH嘿甩∷、第びB≥嘿甩リンパ拣嘿甩废、DOHH-2第びWSU-NHLにおいて囱弧した。滦救弄に、Ztnfr12颁帕灰券附は、缔拉Tリンパ拣嘿甩∈Jurkat∷、帽甸球缝陕嘿甩∈THP-1第びU937∷、涟裹狂靛拉球缝陕嘿甩∈HL-60∷第び她拉裹狂拉球缝陕嘿甩∈K562∷においては浮叫できなかった。
≮0522≯
それらの冯蔡は、Ztnfr12タンパク剂が、Burkitt∏sリンパ拣、润Hodgkin∏sリンパ拣、缔拉リンパ碴靛拉球缝陕、第び硷」の戮のB≥嘿甩リンパ拣に滦して、モノクロ〖ナル钩挛迹闻においては、铜脱な筛弄湿を捏丁することを绩す。Ztnfr12券附は、梧击する减推挛の券附レベルに孺秤して、それらの嘿甩废の驴くにおいて陵碰に光い。毋えば、BCMAは、缝搦嘿甩惧で肩に券附されると蛔われる。
≮0523≯
≮山6≯


≮0524≯
毋4ˉZtnfr12≥Fc突圭タンパク剂の菇喇第び券附
AˉIgγ1フラグメントの侯澜
Ztnfr12≥Fc突圭タンパク剂を拇澜するために、ヒトIgG1のFc挝拌∈ヒンジ挝拌、第びCH2第びDH3ドメイン∷を饯峻し、Fcγ1减推挛∈FcγR1∷第び输挛∈C1q∷冯圭怠墙を近殿した。ヒトIgG1Fcのこの饯峻されたバ〖ションを、∪Fc4∩と炭叹した。
≮0525≯
Fc挝拌を、ヒト论基次隆ライブラリ〖∈Clontech∷PCRから、肌のオリゴプライマ〖を脱いて帽违した¨5∏ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC3∏∈芹误戎规15∷第び5∏GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG3∏∈芹误戎规16∷。填栏房ヒトγ稍恃挝拌のヌクレオチド第びアミノ焕芹误は、それぞれ芹误戎规17第び18で山される。Fc挝拌柒の仆脸恃佰を、PCRにより瞥掐し、FcγR1冯圭を你めた。FcγRI冯圭婶疤∈Leu≥Leu≥Gly≥Gly〃EUインデックス疤弥234×237に滦炳する芹误戎规18のアミノ焕荒答38≥41∷を、Ala≥Glu≥Glu≥Alaに仆脸恃佰投券し、FcγRI冯胳を负じた∈毋えば、Duncanなど., Nature 332: 563 (1988); Baumなど., EMBO J. 13: 3992 (1994) を徊救のこと∷。
≮0526≯
オリゴヌクレオチドプライマ〖¨5∏CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C3∏∈芹误戎规19∷第び5∏GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A3∏∈芹误戎规20∷を脱いて、仆脸恃佰を瞥掐した。570ngのIgFc抿房、5μlの10∵Pfu瓤炳此咀闭∈Stratagene∷、8μlの1.25mMのdNTP, 31μlの绝伪垮、2μlの20mMのオリゴヌクレオチドプライマ〖を藕裁し、50μlの呵姜挛姥にした。
≮0527≯
霹挛姥の观听を藕裁し、そして瓤炳を94☆に1尸粗、裁钱した。Pfuポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、鲁いて、94☆で30擅、55☆で30擅、72☆で1尸∈25サイクル∷、鲁いて72☆での7尸粗の变墓を乖った。瓤炳栏喇湿を、排丹彼瓢により尸侍し、そして腆676宾答滦の徒卢されるサイズに滦炳するバンドを浮叫した。このバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、ゲルから磊近し、そして搀箭した。このフラグメントを、FcγRI冯圭婶疤仆脸恃佰投券されたIgFc芹误として炭叹した。
≮0528≯
PCRをまた脱いて、AlaのSer∈EUインデックス疤弥330に滦炳する、芹误戎规18のアミノ焕荒答134∷への仆脸恃佰第びProのSer∈EUインデックス疤弥331に滦炳する、芹误戎规18のアミノ焕荒答135∷への仆脸恃佰を瞥掐し、输挛C1q冯圭唆は输挛盖年を负じた∈Duncan and Winter, Nature 332: 788 (1988)∷。2硷の妈1搀誊の瓤炳を、抿房としてFcγI冯圭婶疤≥仆脸恃佰投券されたIgFc芹误を脱いて乖った。
≮0529≯
1μlのFcγRI冯圭婶疤≥仆脸恃佰投券されたIgFc抿房、5μlの10∵Pfu瓤炳此咀闭∈Stratagene∷、8μlの1.25mMのdNTP、 31μlの绝伪垮、2μlの20mMの5∏GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC3∏∈芹误戎规21∷、すなわち芹误戎规17のヌクレオチド36で倡幌する5∏プライマ〖、第び2μlの20mMの5∏TGGGAGGGCT TTGTTGGA3∏∈芹误戎规22∷、すなわち芹误戎规17のヌクレオチド405の输挛で倡幌する3∏プライマ〖を藕裁し、50μlの呵姜挛姥にした。
≮0530≯
妈2瓤炳は、AlaからSerへの仆脸恃佰投券、XbaI扩嘎婶疤第び匿贿コドンを瞥掐するために、オリゴヌクレオチドプライマ〖5∏TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC3∏∈芹误戎规23∷、すなわち芹误戎规17のヌクレオチド388で倡幌する5∏プライマ〖第び5∏GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG3∏∈芹误戎规24∷、すなわち3∏プライマ〖の20mMの付闭をそれぞれ2μlを崔んだ。霹挛姥の观听を藕裁し、そして瓤炳を94☆に1尸粗、裁钱した。
≮0531≯
Pfuポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、鲁いて、94☆で30擅、55☆で30擅、72☆で1尸∈25サイクル∷、鲁いて72☆での7尸粗の变墓を乖った。瓤炳栏喇湿を、排丹彼瓢により尸侍し、そして腆370第び腆395宾答滦の徒卢されるサイズに滦炳するバンドを浮叫した。このバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、ゲルから磊近し、そして藐叫した。
≮0532≯
惧淡フラグメントを息冯し、そして5∏BamHI扩嘎婶疤、第びヒト倘敝グロブリンJBL 2∏CLH嚎材恃挝拌からのシグナル芹误を烧裁するために、妈2搀誊の瓤炳を乖った∈Cogneなど., Eur. J. Immunol. 18: 1485 (1988)∷。30μlの绝伪垮、8μlの1.25mMのdNTP, 5μlの10∵Pfuポリメラ〖ゼ瓤炳此咀闭∈Stratagene∷第び2硷の妈1搀誊のPCR瓤炳湿の改」の1μlを藕裁し、50μlの呵姜挛姥にした。霹挛姥の观听を藕裁し、そして瓤炳を94☆に1尸粗、裁钱した。Pfuポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、鲁いて、94☆で30擅、55☆で30擅、第び72☆で2尸∈5サイクル∷、PCR瓤炳を乖った。
≮0533≯
补刨を94☆に浩び惧げ、そして5∏GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG3∏∈芹误戎规25∷、すなわちBamHI扩嘎婶疤を瞥掐する、芹误戎规17のヌクレオチド1で倡幌する5∏プライマ〖、第び5∏GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A3∏∈芹误戎规26∷の20mMの付闭それぞれ2μlを藕裁し、鲁いて、94☆で30擅、55☆で30擅、第び72☆で2尸第び72☆で呵姜7尸の橙磨∈25サイクル∷を乖った。涟淡瓤炳の办婶を、ゲル排丹彼瓢を脱いて材浑步した。
≮0534≯
徒卢されるサイズに滦炳する789宾答滦バンドを浮叫した。仆脸恃佰投券されたFc PCRフラグメントの荒りを、扩嘎冠燎BamHI第びXbaIにより久步した。久步されたフラグメントをクロ〖ン步し、そして芹误尸老により澄かめた。仆脸恃佰投券されたFcを、∪Fc4∩と炭叹した。Fc4のヌクレオチド第びアミノ焕芹误は、それぞれ芹误戎规27第び28として捏丁されている。
≮0535≯
∪Fc5∩と疚するIg突圭セグメントを、肌のオリゴヌクレオチドプライマ〖によりFc4 Ig突圭セグメントを笼升するためにPCRを脱いることによって栏喇した¨5∏GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA3∏∈芹误戎规29∷第び5∏TAATTGGCGC GCCTCTAGAT TATTTACCCG GAGACA3∏∈芹误戎规30∷。PCR笼升の掘凤は肌の奶りであった。236ngのFc4抿房、5μlの10∵Pfu瓤炳此咀闭、4μlの2.5mMのdNTP、1μlのそれぞれ20μMのプライマ〖第び1μlのPfuポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、50μlの呵姜挛姥にした。
≮0536≯
笼升钱プロフィ〖ルは、94☆で15擅、42☆で20擅、72☆で45擅∈5サイクル∷、94☆で15擅、72☆で1尸20擅∈20サイクル∷、鲁いて72☆での7尸の橙磨から喇った。瓤炳栏喇湿を、尸违脱アガロ〖スゲル惧で排丹彼瓢借妄し、そして718bpの徒卢されるサイズに滦炳するバンドを浮叫した。QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、バンドをゲルから磊近し、そして搀箭した。仆脸恃佰投瞥されたFcフラグメントをクロ〖ン步し、そして芹误尸老により澄かめた。Fc5のヌクレオチド第びアミノ焕芹误を、それぞれ芹误戎规31第び32として捏丁する。
≮0537≯
BˉZtnfr12≥Fc5券附ベクタ〖の侯澜
Ztnfr12-tcs-Fc5のための券附カセットをコ〖ドするタンパク剂を、PCR抿房としてマウス倘敝グルブリンH嚎材恃挝拌∈IgVH∷シグナル芹误cDNA、Ztnfr12 cDNA第びFc5 DNAフラグメントを脱いて、オ〖バ〖ラップPCR∈Hortonなど., Gene 77: 61 (1989)∷により栏喇した。脱胳∪tcs∪とは、Ztnfr12セグメントをFc5セグメントとのトロンビン尸豺婶疤の赂哼を绩す。
妈1搀誊のPCR笼升は、妈2搀誊のオ〖バ〖ラップPCRに蝗脱される4硷のPCR栏喇湿∈妈1搀誊のPCR栏喇湿1·2·3第び4として炭叹される∷を栏喇する4硷の侍」の瓤炳から喇った。
≮0538≯
妈1搀誊のPCR栏喇湿1·2·3第び4を、佰なったオリゴヌクレオチドプライマ〖第びDNA抿房を脱いて、侍」に栏喇した。腆2ngの抿房DNA、2.5μlの10∵Pfuポリメラ〖ゼ瓤炳此咀闭∈Stratagene∷、2μlの2.5mMのdNTP, 2.5μlのRediload∈ReGen; Huntsville, AL∷、20pモルの改」の5∏オリゴヌクレオチド第び3∏オリゴヌクレオチドプライマ〖∈布淡を徊救のこと∷、第び0.5μlのPfuポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、それぞれ25μlの呵姜挛姥にした。妈1搀誊のPCR栏喇湿4を栏喇する瓤炳はまた、2.5μlのGC≥Melt活挑∈Clontech∷の藕裁を蜀崔した。PCR笼升に蝗脱される抿房第びプライマ〖に滦する攫鼠は、山7第び8に捏丁される。
≮0539≯
≮山7≯


≮0540≯
≮山8≯


≮0541≯
笼升钱プロフィ〖ルは、94☆で3尸、94☆で30擅、55☆で30擅、72☆で2尸∈30サイクル∷、鲁いて72☆での4尸の橙磨から喇った。瓤炳栏喇湿を、アガロ〖スゲル排丹彼瓢を脱いて尸侍し、そして徒卢されるサイズに滦炳するバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、ゲルから磊近し、そして搀箭した。
≮0542≯
妈2搀誊のPCR笼升、唆はオ〖バ〖ラップPCR笼升瓤炳を、DNA抿房として涟淡妈1搀誊のPCRからのゲル篮澜されたフラグメントを脱いて乖った。妈2搀誊のPCR笼升の掘凤は肌の奶りであった。1μlの改」の妈1搀誊のPCR栏喇湿1·2·3第び4、5μlの10∵Pfuポリメラ〖ゼ瓤炳此咀闭∈Stratagene∷、4μlの2.5mMのdNTP, 5μlのRdiload (ResGen), 5μlのGC≥Melt活挑∈Clontech∷、腆40pモルの改」のZC38,989, ZC38,874第び0.5μlのPfu ポリメラ〖ゼ∈2.5帽疤、Stratagene∷を藕裁し、50μlの呵姜挛姥にした。笼升钱プロフィ〖ルは、94☆で3尸、94☆で30擅、55☆で30擅、72☆で3尸∈35サイクル∷、鲁いて72☆で6尸の橙磨から喇った。∪Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR∩と疚する瓤炳栏喇湿を、アガロ〖スゲル排丹彼瓢を脱いて尸侍し、そして徒卢されるサイズに滦炳するバンドを、QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen) を脱いて、澜陇度荚の棱汤今に骄って、ゲルから磊近し、そして搀箭した。
≮0543≯
Ztnfr12-tcs-Fc5 PCR栏湿を、Invitrogen∏s ZEROBLUNT TOPO PCR Cloning Kit を脱いて、澜陇度荚の夸力されるプロトコ〖ルに骄ってクロ〖ン步し、そしてそのDNA芹误を澄かめた。Ztnfr12-tcs-Fc5のヌクレオチド第びアミノ焕芹误を、それぞれ芹误戎规41第び42として捏丁する。芹误戎规42においては、ネズミVH26-10シグナル芹误は、アミノ焕荒答1≥19により山され、Ztnfr12嘿甩嘲ドメインは、アミノ焕荒答20≥90∈すなわち、芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71∷により山され、トロンビン尸豺婶尸は、アミノ焕荒答91≥96により山され、そしてFc5倘敝グロブリン喇尸はアミノ焕荒答97≥328により山される。
≮0544≯
芹误を澄千されたZtnfr12-tes-Fc5をコ〖ドするプラスミドを、FseI第びAccIにより久步し、そのコ〖ドセグメントを倡庶した。FseI≥AscIフラグメントを、サイトメガロウィルスプロモ〖タ〖∈CMV∷プロモ〖タ〖、SV40ポリAセグメント第びネズミジヒドロ撬蝉レダクタ〖ゼ颁帕灰を崔む赢讫梧券栏ベクタ〖面に息冯した。
≮0545≯
毋5ˉチャイニ〖ハムスタ〖婉零嘿甩によるZtnfr12≥Fcタンパク剂の栏喇
Ztnfr12-Fc5券附菇喇挛を脱いて、瓢湿タンパク剂フリ〖の禽孟において笼升された、伏蛮≥努圭されたチャイニ〖ズハムスタ〖婉零∈CHO∷DG44嘿甩を、エレクトロポレ〖ションを奶してトランスフェクトした∈Urlanbなど., Sam. Cell. Malec. 12:555(1986)∷。CHO DG44嘿甩は、尉ジヒドロ驼焕レダクタ〖ゼ厉咖挛疤弥での风己のために、怠墙弄ジヒドロ驼焕レダクタ〖ゼ颁帕灰を风いている。光められた腔刨のメトトレキセ〖トの赂哼布での嘿甩の笼浚は、ジヒドロ驼焕レダクタ〖ゼ颁帕灰の笼升、第び券附菇喇挛惧での息冯された寥垂えタンパク剂コ〖ド颁帕灰の笼升をもたらす。
≮0546≯
CHO DG44嘿甩を、PFCHO禽孟∈JRH Biosciences, Lenexa, KS∷、4mMのL≥グルタミン∈JRH Biosciences∷、第び1∵ヒポサンキシン≥チミジンサプリメント∈Life Technologies∷において费洛し、そして嘿甩を、搀啪慷饣プラットフォ〖ム惧で120RPMで、Corning慷饣フラスコにおいて37☆第び5◇CO2布でインキュベ〖トした。嘿甩を、俐觉步された券附プラスミドにより侍」にトランスフェクトした。
≮0547≯
糖遁を澄かめるために、帽办のエタノ〖ル睦怕檬超を、20μlの羊们されたサケ篮灰キャリヤ〖DNA∈5∏ⅹ3∏Inc, Boulder, Co, 10ng/ml∷、 22μlの3MのNaOAc∈pH5.2∷第び484μlの100◇エタノ〖ル∈Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA∷と鼎に、Eppendorf瓷において200μgのプラスミドDNAを寥圭すことによって、25尸粗、晒惧で乖った。インキュベ〖ションの稿、瓷を、4☆の婶舶に芹弥された斌看尸违怠において14,000RPMで斌看尸违し、惧蓝闭を近殿し、そしてペレットを70◇エタノ〖ル0.5mlにより2刨、丽爵し、そして鄂丹触羚せしめた。
≮0548≯
DNAペレットを、25mlの边宽妨斌看尸违瓷において900RPMで5尸粗、圭纷106改の嘿甩∈16.5ml∷を斌看尸违することによって触羚しながら、CHO DG44嘿甩を拇澜した。CHO DG44嘿甩を、圭纷挛姥300μlのPFCHO笼浚禽孟面に浩伏蛮し、そして0.4cmの排端ギャップを铜するGene≥Pulser Cuvette∈Bio≥Rad∷に芹弥した。腆50尸の触羚箕粗の稿、DNAを、500μlのPFCHO笼浚禽孟面に浩伏蛮し、そして圭纷挛姥が800μlを臂えないよう、キュベットにおける嘿甩に藕裁し、そして技补で5尸粗、琅弥し、刷の妨喇を你めた。キュベットを、0.296kV∈キロボルト∷第び0.950HC∈光キャパシタンス∷で肋年されたBioRad Gene Pulser IIユニットに芹弥し、そしてすぐにエレクトロポレ〖トした。
≮0549≯
嘿甩を技补で5尸粗インキュベ〖トし、その稿、CoStar T-75フラスコにおける圭纷20mlの挛姥のPFCHO禽孟に芹弥した。フラスコを、37☆で5◇CO2布に48箕粗、芹弥し、肌に嘿甩を、トリパンブル〖怯近を脱いて缝靛纷眶纷により纷换し、そしてヒポサンキシン≥チミジンサプリメントを崔まないが、20mMのメトトレキセ〖トを崔むPFCHO联买禽孟∈Cal Biochem∷面に芹弥した。メトトレキセ〖ト联买供镍の搀牲に答づいて、联买されたZtnfr12≥Fc5タンパク剂を崔むならし禽孟を、ウェスタ〖ンブロット尸老により活赋した。
≮0550≯
1つの甫垫においては、突圭タンパク剂を肌の奶りにして篮澜した。CHO嘿甩からのならし禽孟10Lを譬汤にし、そして0.22μmのフィルタ〖を奶して痰遁呱册した。肌に、呱册された禽孟サンプルを、Ztnfr12≥Fc5筛弄尸灰の梳惩のために72mlのプロテインAカラム∈Poros 50A∷に努脱した。傅の努脱からの萎瓢亨瘟を、プロテインAカラム惧で2刨、浩借妄し、呵络の搀箭拉を笼动した。润丛傅拉SDS≥PAGEによる尸老は、この檬超で搀箭された冯圭亨瘟がマルチマ〖第びダイマ〖の尉荚であることを绩した。丛傅拉SDS≥PAGEによる尸侍の稿、36kDの尸灰翁を铜するモノマ〖突圭タンパク剂のみが囱弧された。肌に、Ztnfr12≥Fc5硷の搀箭された寒圭湿を、Superdex≥200サイズ近殿クロマトグラフィ〖カラム∈318ml∷に努脱し、涟淡亨瘟をさらに篮澜し、そして此咀闭≥蛤垂した。この檬超は、マルチマ〖亨瘟からのダイマ〖亨瘟の尸豺を捏丁した。
≮0551≯
毋6ˉZtnfr12≥Fc突圭タンパク剂の泼拉疯年
エドマン尸豺を乖い、Ztnfr12≥Fc突圭タンパク剂のN≥琐眉を票年した。この冯蔡は、N≥琐眉が久步され、そして呵介のアミノ焕がSer7であることを绩す。
Ztnfr12≥Fcを、筛洁祷恕を脱いて、トロンビンにより久步した。缄没に咐第すれば、トロンビン久步を、トロンビンをタンパク剂に1¨25の脚翁孺で藕裁し、そして技补で60尸粗インキュベ〖トすることによって乖った。瓤炳を、尸老のLC尸违婶尸のために、嫡陵HPLCカラム惧へのすぐの庙掐により匿贿した。嫡陵カラムからの拖叫闭を、LCQ剂翁尸各纷に羹け、そしてMS第びMS/MSデ〖タを礁めた。改」の久步湿を、丛傅を燃って第びそれを燃なわないで尸老し、そして泼佰弄に搀箭されたことが囱弧されたピ〖クを、材墙な眷圭、剂翁努圭第び芹误∈MS/MS∷澄千尸老により票年した。タンパク剂のトロンビン久步は、菇蜜された婶疤の戮に、Ztnfr12ドメインにおける肌の2硷の磊们婶疤の赂哼を票年した¨Arg39≥Thr40第びArg54≥Thr55。
≮0552≯
Fcドメインのプロテア〖ゼ卵拉のために、グルコシル步饯峻は、タンパク剂のその婶尸については囱弧されなかった。帽办の徒卢されるN≥冯圭された煤垮步湿は、Asn159でFcドメインに赂哼する。
≮0553≯
しかしながら、驴くの佰硷O≥グリカンがZtnfr12ドメインに冯圭されることが囱弧された。それらのO≥グリカンの浇尸に妨喇された菇陇は、CHO嘿甩において寥垂え弄に栏喇されるタンパク剂惧に斧叫される、涟に泼魔づけられたO≥グリカンと办米し、そしてテトラ≥サッカリドの妨、すなわち∈N≥アセチルヘキソサミン∷≥∈N≥アセチルノイラミン焕∈すなわち、シアル焕∷∷≥∈ヘキソ〖ス∷≥∈N≥アセチルノイラミン焕∷である。囱弧される呵も庭拉妨は、トリ≥サッカリド、すなわち∈N≥アセチルヘキソサミン∷≥∈ヘキソ〖ス∷≥∈N≥アセチルノイラミン焕∷であった。
≮0554≯
改」の婶疤は、帽办のN≥アセチルヘキソサミン×浇尸に妨喇されたテトラ≥サッカリドの认跋の剩眶妨の煤垮步湿により婶尸弄に第び佰硷弄に狸铜されることが囱弧された。煤垮步湿の佰硷拉第びこの尸老の稍窗链な拉剂のために、◇婶疤狸铜唯の汤澄な充り碰ては稍材墙であった。いくらかのレベルで饯峻されることが囱弧された荒答は、Thr17, Thr40, Ser49, Ser50, Thr55第びSer62であった。それらの煤垮步湿饯峻は、Fcドメインに帽办のN≥冯圭された煤垮步湿のみを铜するこの突圭タンパク剂とTACI≥Fcとを惰侍する。
≮0555≯
Ztnfr12≥Fc5を、ヤギ钩≥ヒトIgG Fcにより蕊胜されたプレ〖トに盖年し、そしてZTNF4≥ビオチンと鼎にインキュベ〖トした。この甫垫の冯蔡は、Ztnfr12≥Fc5がZTNF4を冯圭することを绩した。纳裁の甫垫は、Ztnfr12≥Fc5が、材拖拉ZTNF4第び寥垂えヒトIL-4により票箕宠拉步されたヒト琐究缝闭嘿甩の笼浚を了巢し、そしてZtnfr12≥Fc5が材拖拉TACI减推挛へのZTNF4≥ビオチン冯圭を了巢したことを绩した。
≮0556≯
毋7ˉ材拖拉Ztnfr12のバキュロウィルスでの券附
券附ベクタ〖pZBV37L: sTNFR12ceeを、帽办ペプチドの尸豺の稿、C≥琐眉∪EE∩筛急∈EYMPMD〃芹误戎规45∷を铜する材拖拉Ztnfr12ポリペプチド∈芹误戎规2のアミノ焕荒答1≥71∷を券附するよう措茶した。
≮0557≯
AˉpZBV37L: sTNFR12ceeの菇喇
それぞれ5∏第び3∏琐眉惧にBspeI第びXbaI扩嘎婶疤を崔む、257宾答滦のsTNFR12ceeフラグメントを、肌のプライマ〖を脱いて、Ztnfr12 cDNAを崔むプラスミドからのPCR笼升により栏喇した¨5∏ATGCATTCCG GAATGAGGCG AGGGCCCCGG AGCCTG3∏∈芹误戎规43∷第び5∏ATGCATTCTA GATCAGTCCA TCGGCATGTA TTCCGCCGCC TCGCCGGCCC CCGC3∏∈芹误戎规44∷。PCR瓤炳掘凤は、10◇DMSOを崔む100μlの挛姥の瓤炳について、Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) を脱いて、肌の奶りであった¨94☆で2尸∈1サイクル∷〃94☆で15擅、50☆で30擅、第び72☆で45擅∈35サイクル∷〃72☆で5尸∈1サイクル∷〃鲁いて、4☆でのソ〖キング。
≮0558≯
5μlの瓤炳寒圭湿を、ゲル排丹彼瓢∈1◇MuSieveアガロ〖ス∷により材浑步した。瓤炳寒圭湿の荒りを、Qiagen PCR篮澜キットを奶して、澜陇度荚の棱汤今に骄って篮澜し、そして30μlの垮に拖叫した。cDNAを、37☆で1箕粗、努磊な此咀闭掘凤布でBspeI第びXbaI∈New England Biolabs, Beverly, MA∷を脱いて35μlの挛姥において久步した。久步されたPCR栏喇湿バンドを、1◇アガロ〖スTAEゲルを奶して活赋し、磊近し、QIQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen)を脱いて藐叫し、そして30μlの垮に拖叫した。篮澜され、久步されたsTNFR12cee PCR栏喇湿を、涟に拇澜され、そして扩嘎冠燎久步された∈BspeI第びXbaI∷ベクタ〖pZBV37LのMCS面に息冯した。
≮0559≯
pZBV37Lベクタ〖は、ポリへドロンプロモ〖タ〖が近殿され、そして剩眶クロ〖ニング婶疤の惧萎の稿袋宠拉步Basic Protein Promoter第びEGTリ〖ダ〖シグナル芹误により弥垂されている、PFASTBAC1∈Life Technologies∷の饯峻挛である。5μlの扩嘎久步されたsTNFR12cee第び腆50ngのその滦炳するpZBV37Lベクタ〖を、努磊な此咀闭掘凤布で20μlの挛姥において16☆で办日、息冯した。5μlの息冯寒圭湿を脱いて、2mmのギャップエレクトロポレ〖ションキュベット∈BTX∷において、400オ〖ム、2V第び25μFでのエレクトロポレ〖ションにより、50μlのELECTOMAX DH12S嘿甩∈Life Technologies∷を妨剂啪垂した。妨剂啪垂された嘿甩を、350μlのSOS禽孟∈2◇ Bacto Tryptone, 0.5◇ Bacto Yeast Extract, 10mlの1MのNaCl、1.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4第び20mMのグルコ〖ス∷により歹坚し、37☆で1箕粗インキュベ〖トし、そして50μlの歹坚拖闭を、100μg/mlのアンピシリンを崔むLBプレ〖ト惧にプレ〖トした。
≮0560≯
クロ〖ンをPCR第び扩嘎久步により尸老した。哇拉クロ〖ンを联买し、プレ〖トし、そして芹误疯年のために捏丁した。赖しい芹误が澄かめられると、25ngの哇拉クロ〖ンDNAを脱いて、42☆での钱ブロックにおける45擅粗の钱ショックにより、100μlのDH10BAC MAX EFFICIENCYコンピテント嘿甩∈GIBCO-BRL∷を妨剂啪垂した。妨剂啪垂されたDH10BAC嘿甩を、900μlのSOC禽孟∈1◇Bacto Trypton, 0.5◇Bacto Yeast Extract, 10mlの1MのNaCl、1.5mMのKCl, 10mMのMgCl2、10mMのMgSO4第び20mMのグルコ〖ス∷により歹坚し、37☆で1箕粗インキュベ〖トし、そしてその100μlを、50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、40μg/mlのIPTG第び200μl/mlのBLUO≥GAL∈5≥ブロモ≥3≥インドリル≥β≥D≥ガラクトピラノシド∷を崔むLuria川欧プレ〖ト惧にプレ〖トした。プレ〖トを37☆で48箕粗インキュベ〖トした。
≮0561≯
咖禾联买を脱いて、啪败されたウィルスDNA∈∪bacmid∩として咐第される∷を铜するそれらの嘿甩を票年した。球咖のそれらのコロニ〖を何艰した。哇拉の球咖コロニ〖∈疥司するbacmidをふくむ∷を、笼浚第び鲁くbacmid DNA篮澜のために联买した。スポドプテラˇフルギペルダ∈Spodoptera frugiperda∷∈Sf9∷嘿甩を、禽蛙笼浚第びbacmid帽违の稿、トランスフェクトした。
≮0562≯
BˉSf9嘿甩のトランスフェクション
Sf9嘿甩を、6≥ウェルプレ〖トに、1∵106改の嘿甩/ウェルで儡卡し、そして27☆で1箕粗、烧缅せしめた。腆5μgのbacmid DNAを、100μlのSf≥900II SFM (Life Technologies) により歹坚した。20μlのLIPOFECTAMINE活挑∈Life Technologies∷を、100μlのSf≥900II SFMにより歹坚した。bacmid DNA第び婚剂拖闭を汾く寒圭し、そして技补で45尸粗インキュベ〖トした。800μlのSf≥900II SFMを、涟淡婚剂≥DNA寒圭湿に藕裁した。禽孟をウェルから帝苞し、そして1mlのDNA≥婚剂寒圭湿を嘿甩に藕裁した。嘿甩を27☆で办日インキュベ〖トした。DNA≥婚嗣寒圭湿を帝苞し、そして2mlのSf≥900II禽孟を改」のプレ〖トに藕裁した。プレ〖トを、27☆、90◇季刨で、腆7泣粗インキュベ〖トし、そしてウィルスを箭诚した。
≮0563≯
Cˉ笼升
Sf9嘿甩を、2mlのSF≥900IIを崔む6≥ウェルプレ〖トに、1∵106改の嘿甩/ウェルで儡硷した。トランスフェクションプレ〖トからの500μlのウィルスを、ウェルにプレ〖トし、そしてプレ〖トを、27☆、90◇季刨で96箕粗インキュベ〖トし、この稿、ウィルスを、办肌笼升のために箭诚した。纳裁の笼升を、肌の数恕を脱いて茫喇することができる。
≮0564≯
妈2搀誊の笼升を、肌の奶りに渴乖することができる¨Sf9嘿甩を、2mlのSF≥900IIを铜する6≥ウェルプレ〖トに、1∵106改の嘿甩/ウェルで儡硷する。办肌笼升プレ〖トからのウィルス100μlをウェルにプレ〖トし、そしてプレ〖トを27☆、90◇季刨で96箕粗インキュベ〖トし、そして肌に、ウィルスを企肌笼升を窗冯するために箭诚した。
纳裁の笼升を乖うことができる。Sf9嘿甩を、250mlの慷饣フラスコにおける50mlのSf≥900II SFMにおいて、1∵106改の嘿甩/mlのおおよその泰刨まで笼浚する。肌に、それらを惧淡プレ〖トからの500μlのウィルス付闭により炊厉せしめ、そして27☆で3箕粗インキュベ〖トし、この稿、ウィルスを箭诚する。
≮0565≯
このウィルス付闭を、笼浚了巢妒俐により农年し、そして1のMOIを绩す农年禽蛙湿を圭纷48箕粗、渴乖せしめる。惧蓝闭を、zVegf4∈E3595∷のGFDに滦して泼佰弄な办肌モノクロ〖ナル钩挛、第びHRP儡圭されたヤギ钩挛≥Mu企肌钩挛を脱いて、润丛傅ウェスタ〖ンにより尸老する。冯蔡は、腆79kDaのダイマ〖バンド第び纳裁の光尸灰翁硷のバンドを绩すべきである。惧蓝闭をまた、宠拉尸老のために蝗脱することができる。
≮0566≯
驴翁のウェルス付闭を肌の数恕により栏喇する¨Sf9嘿甩を、2800mlの慷饣フラスコにおける1LのSf≥900II SFMにおいて、1∵106改の嘿甩/mlのおおよその泰刨まで笼浚する。肌に、それらを、呵稿の笼浚からのウィルス付闭10mlにより炊厉し、そして27☆で96箕粗インキュベ〖トし、この稿、ウィルスを箭诚する。
络惮滔炊厉を窗冯し、布萎の篮澜のための亨瘟を丁惦することができる。
 
≮叫搓客≯   ≮急侍戎规≯500049831
≮会叹唆は叹疚≯ザイモジェネティクス·インコ〖ポレイティド
 
≮叫搓泣≯   士喇21钳5奉19泣∈2009ˉ5ˉ19∷  
≮洛妄客≯   ≮急侍戎规≯100099759
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯滥腾 破

≮急侍戎规≯100077517
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯佬拍 飞

≮急侍戎规≯100087871
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯省塑 姥

≮急侍戎规≯100087413
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯概察 暖肌

≮急侍戎规≯100108903
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯面录 下弓

≮急侍戎规≯100117019
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯畔收 哇办

≮急侍戎规≯100141977
≮售妄晃≯
≮会叹唆は叹疚≯面喷 尽
 
≮给倡戎规≯   泼倡2009≥225798∈P2009≥225798A∷  
≮给倡泣≯   士喇21钳10奉8泣∈2009ˉ10ˉ8∷  
≮叫搓戎规≯   泼搓2009≥120799∈P2009≥120799∷  




 
 

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